Размер имеет значение: Измерение диаметра капсулы в Cryptococcus neoformans

Влияющих на четверть миллиона человек каждый год и в результате более чем 180 000 смертей ежегодно, Cryptococcus neoformans является патогенным, внутриклеточный дрожжей и возбудителя криптококкоза^{1,2, 3}. наибольшей являются ВИЧ позитивных пациентов в бедных странах, которые не имеют доступ к антиретровирусной терапии, что делает их крайне восприимчивы к болезни^4,5,6. Данные из CDC показывают, что в Африке к югу от Сахары, C. neoformans убивает больше людей, чем туберкулеза, ежегодно и более каждый месяц, чем любой вспышки лихорадки Эбола на запись¹. Наиболее распространенные пути воздействия происходит от вдыхания сморщившимися споры, которые являются обычным явлением в среду⁷. При входе в легкие, существует несколько факторов вирулентности, которые внести вклад в успех C. neoformans в инфицированных лиц. Полисахаридной капсулы считается фактором первичного вирулентности микроба, acapsular штаммы являются не вирулентные⁸.

Криптококковый капсула состоит из трех компонентов принцип: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) и mannoproteins (MPs)⁹. Хотя м/с являются относительно незначительными клеточной стенки связанный компонент капсулы, они иммуногенность и может способствовать в основном про воспалительной реакции^9,10. В отличие от GXM и GalXM составляют основную часть капсулы (> 90% по весу) и иммуносупрессивные последствия¹¹. В дополнение к его иммуномодулирующие эффекты быстрое расширение капсулы в естественных условиях создает механический барьер для употребления, принимающих фагоцитирующих клеток (то есть, нейтрофилы и макрофаги)¹². C. neoformans капсулу и его синтеза являются сложными, но в целом, увеличение диаметра капсулы коррелирует с повышенной вирулентности^6,,1314. Учитывая это, важно для C. neoformans исследователей иметь возможность быстро и точно подсчитать капсула измерений.

C. neoformans ячейки и ее полисахаридной капсулы являются динамические структуры и показать изменения за время¹⁵. Капсулы можно изменить плотность, размер и Ассамблея в ответ на изменения в принимающей среде^16,17,18. Инициировать капсулы рост^16,18,,1920известны низкой железа или уровни питательных веществ, воздействие сыворотки, человеческого физиологических рН и увеличение CO₂ . Кроме того исследователи показали структурные изменения, что привело к значительным различиям в иммунореактивности во время инфекции, кредитование преимущество C. neoformans над его пребывания^21,22. Это известно, потому что архитектура C. neoformans капсулы были проанализированы в различных способами. Электронная микроскопия, например, показал, что капсула имеет гетерогенной матрицы с электронно плотные внутренний слой под более проницаемым слоем²³. Рассеяние света и использование Оптический пинцет позволили исследователям для дальнейшего выяснения его макромолекулярных свойства²⁴. Анализируя результаты из обоих измерений статического и динамического рассеяния света, мы знаем, что полисахарид капсулы имеет сложной разветвленной структуры²³. Оптический пинцет были использованы для тестирования жесткость структуры, а также оценить его антитела реактивности²⁴. Однако на сегодняшний день наиболее часто занятых анализ C. neoformans капсулы является измерение его размер.

Для количественного определения размера капсулы, исследователи используют, что должно быть простой измерения: линейный диаметр капсулы. Цифровые микроскопы, используются для захвата изображения нескольких C. neoformans клеток (как правило сотни) окрашенных чернил Индии или флуоресцентными красителями. Размер каждой клетки тела и окружающего капсулы измеряется. Данные компилируются, и средний диаметр капсулы рассчитывается путем вычитания клетки тела диаметром от диаметра всей клетки (клетки тела + капсула). До этого момента эти измерения были сделаны вручную. Хотя в целом точной, этот метод имеет недостатки для исследователей. Большие наборы данных может занять дни или даже недели, чтобы анализировать вручную. И потому, что эти измерения выполняются вручную, субъективности и человеческой ошибки могут повлиять на результат.

Анализ автоматизированной вычислительной изображений стал незаменимым инструментом для исследователей во многих областях молекулярной клеточной биологии, позволяя более быстрый и надежный анализ биологических изображения ^25,,2627. Методы анализа точных изображений необходимо добывать количественную информацию от того, что часто сложных и огромных наборов данных. Однако некоторые измерения, особенно измерения C. neoformans капсула, были трудно автоматизировать. Точно определить интерфейс между клеточной стенки и капсула, которая обычно появляется как кольцо тьмы, когда imaged при фазово контрастной микроскопии, может быть хлопотно для разрешения с помощью простой порог. Кроме того C. neoformans клеток в культуре, как правило, слипаются и точная сегментация клеток необходима для точных измерений.

Цель этого проекта заключалась в (i) иллюстрируют один из стандартных протоколов для капсула индукции в C. neoformans, (ii) сравнить и сопоставить чернил Индии и флуоресценции окрашивание как они относятся к капсуле диаметром измерения, (iii) разработка простой, вычислительные методы для измерения капсул диаметром, с использованием изображений чернил Индии, окрашенных клеток с использованием программного обеспечения для анализа изображений и, (iv) оценить преимущества и ограничения измерения диаметра капсулы вручную и с помощью программного обеспечения автоматизации. Мы обнаружить, что из двух пятная методов, люминесцентные маркировки клеточной стенки и капсула, пока больше времени при условии наиболее последовательных результатов между экспериментов. Однако, оба метода позволило нам успешно проводить различие между лаборатории и клинической C. neoformans экспонируется различных штаммов капсулы размеров. Кроме того мы смогли автоматизировать измерения капсул диаметром от чернил Индии, окрашенные образы и обнаружил, что это была жизнеспособной альтернативой ручного измерения капсулы.