Size Matters : Mesure du diamètre de la Capsule à Cryptococcus neoformans

Affectant un quart de million de personnes chaque année et qui ont fait plus de 180 000 morts chaque année, Cryptococcus neoformans est une levure pathogène intracellulaire et l’agent causal de la cryptococcose^{1,2, 3}. les plus durement touchées sont les patients séropositifs dans les pays pauvres qui n’ont pas facilement accès aux traitements antirétroviraux, ce qui les rend extrêmement sensibles à la maladie^4,5,6. Les données de la CDC indiquent qu’en Afrique subsaharienne, c. neoformans tue plus de personnes que la tuberculose chaque année et plus chaque mois à une épidémie d’Ebola sur record¹. La voie d’exposition la plus courante se produit à l’inhalation de spores desséchés qui sont monnaie courante dans l’ environnement⁷. En entrant dans les poumons, il y a plusieurs facteurs de virulence qui contribuent au succès de c. neoformans chez les individus infectés. La capsule polysaccharidique est considérée comme facteur de virulence primaire de microbe, que capsulée souches non virulentes⁸.

La capsule cryptococcique se compose de trois éléments de principe : glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) et mannoprotéines (MPs)⁹. Alors que les députés sont une composante relativement mineure d’associée à la paroi cellulaire de la capsule, ils sont immunogènes et peuvent favoriser une réponse essentiellement pro-inflammatoire^9,10. En revanche, les GXM et GalXM forment l’essentiel de la capsule (> 90 % en poids) et ont des effets immunosuppressifs¹¹. Outre ses effets immunomodulateurs, l’élargissement rapide de la capsule en vivo crée une barrière mécanique à l’ingestion par l’hôte des cellules phagocytaires (c.-à-d., des neutrophiles et macrophages)¹². La capsule de c. neoformans et sa synthèse sont complexes, mais dans l’ensemble, une augmentation de diamètre capsule est corrélée avec une virulence accrue de^13,6,14. Ceci étant, il est important pour les chercheurs de c. neoformans pouvoir rapidement et précisément quantifier les mesures capsules.

La cellule c. neoformans tant sa capsule de polysaccharide sont des structures dynamiques et montrent des changements au fil du temps¹⁵. La capsule peut changer dans la densité, la taille et l’Assemblée en réponse aux changements dans l’hôte environnement^16,17,18. Faible teneur en fer ou niveaux d’éléments nutritifs, exposition au sérum, le pH physiologique humain et une augmentation du CO₂ sont connus pour ouvrir la capsule croissance^16,18,19,20. En outre, les chercheurs ont montré des changements structurels, ce qui entraîne des différences significatives dans l’immunoréactivité lors d’une infection, prêt un avantage à c. neoformans sur son hôte^21,22. Ceci est connu parce que l’architecture de la capsule de c. neoformans a été analysée dans une variété de façons. Microscopie électronique, par exemple, a révélé que la capsule a une matrice hétérogène avec une couche interne dense aux électrons sous une couche extérieure, plus perméable²³. Diffusion de la lumière et l’utilisation de pinces optiques ont permis aux chercheurs d’élucider davantage ses propriétés macromoléculaires²⁴. Analyse des résultats de ces deux mesures de diffusion de la lumière statique et dynamique, nous savons que la capsule polyosidique a un complexe de la structure ramification²³. Des pinces optiques ont été utilisés pour tester la rigidité de la structure mais aussi à évaluer son anticorps réactivité²⁴. Cependant, l’analyse de loin le plus souvent indépendants de la capsule de c. neoformans est la mesure de sa taille.

Afin de quantifier la taille de la capsule, les chercheurs utilisent ce que devrait être une mesure simple : le diamètre linéaire de la capsule. Microscopes numériques sont utilisées pour capturer des images de plusieurs cellules de c. neoformans (généralement des centaines) colorés avec l’encre de Chine ou colorants fluorescents. La taille de chaque corps cellulaire et de la capsule environnante est mesurée. Les données sont compilées, et le diamètre moyen de la capsule est calculé en soustrayant le diamètre du corps cellulaire du diamètre à germes entiers (corps cellulaire + capsule). Jusqu’à présent, ces mesures ont été faites manuellement. Bien que généralement exacte, cette méthode a des inconvénients pour les chercheurs. Ensembles de données volumineux peut prendre des jours ou même des semaines pour analyser à la main. Et parce que ces mesures sont effectuées manuellement, la subjectivité et l’erreur humaine peuvent affecter le résultat.

Analyse d’image informatique automatisé est devenu un outil indispensable pour les chercheurs dans de nombreux domaines de la biologie cellulaire et moléculaire, permettant une analyse plus rapide et plus fiable des images biologiques ^25,26,27. Techniques d’analyse précise de l’image sont nécessaires pour extraire des informations quantitatives de ce qui sont souvent des ensembles de données complexes et immenses. Toutefois, certaines mesures, notamment la mesure de la capsule de c. neoformans , été difficiles à automatiser. Identifier avec précision l’interface entre la paroi cellulaire et de la capsule, qui apparaît généralement comme un anneau sombre lorsqu’imagée par microscopie à contraste de phase, peut être gênante résoudre à l’aide d’un simple seuil. En outre, les cellules en culture de c. neoformans ont tendance à s’agglomérer et segmentation précise des cellules est nécessaire pour des mesures précises.

Ce projet vise à (i) illustrent un des protocoles standards pour capsule induction dans c. neoformans, (ii) comparer et contraster l’encre de Chine et coloration de fluorescence en ce qui concerne pour capsule mesures de diamètre, (iii) développer simple, méthodes de calcul pour mesurer le diamètre capsule à l’aide d’images d’encre teinté de cellules à l’aide d’un logiciel d’analyse image et, (iv) évaluent les avantages et les limites de mesure diamètre capsule manuellement et à l’aide d’automation de logiciel. Nous conclure que les deux méthodes de coloration, fluorescent d’étiquetage de la paroi cellulaire et de la capsule, alors que plus de temps, a fourni les résultats les plus cohérents entre les expériences. Toutefois, les deux méthodes nous a permis de distinguer avec succès entre le laboratoire et clinique c. neoformans souches présentant différents capsule tailles. En outre, nous avons pu automatiser la mesure du diamètre capsule de l’encre de Chine coloré des images et trouvé que c’était une alternative viable à la mesure manuelle de la capsule.