גודל ענייני: מדידה של הקפסולה בקוטר של neoformans קריפטוקוקוס
Summary
הקפסולה רב-סוכר הוא הגורם העיקרי התקפה אלימה , קריפטוקוקוס neoformans , גודלו בקורלציה עם זן התקפה אלימה. מידות קוטר קפסולה משמשים בבדיקות פנוטיפי וכדי להעריך את היעילות הטיפולית. כאן מוצגת שיטה סטנדרטית האינדוקציה קפסולה, שתי שיטות של צביעת ומדידת קוטר מושווים.
Abstract
הקפסולה רב-סוכר של קריפטוקוקוס neoformans היא הגורם העיקרי התקפה אלימה ולמד ביותר בדרך כלל ההיבטים של שמרים החולני הזה. גודל קפסולה יכולה להשתנות בין זנים, יש את היכולת לצמוח במהירות כאשר הציג בפני תנאים מזין מלחיץ או נמוך, יש כבר בקורלציה חיובית עם זן התקפה אלימה. מסיבות אלו, הגודל של הקפסולה הוא עניין רב לחוקרים neoformans ג . הצמיחה של הקפסולה ג neoformans הנגרמת במהלך הבדיקה פנוטיפי כדי לעזור להבין את ההשפעות של טיפולים שונים על שמרים או גודל ההבדלים בין זנים. כאן נתאר באחת השיטות סטנדרטי של קפסולה אינדוקציה והשווה שני המקובלים שיטות של צביעת ומדידת קוטר קפסולה: אינדיה אינק (i), כתם שלילי, בשימוש יחד עם מיקרוסקופ אור קונבנציונלי ו (ii) שיתוף מכתים עם צבעי פלורסנט הן של דופן התא והן את הקפסולה ואחריו מיקרוסקופיה קונפוקלית. לבסוף, אנו מראים איך מדידה של קוטר קפסולה מדגימות שהוכתמו אינדיה אינק יכול להיות אוטומטי באמצעות ניתוח תמונות חישובית.
Introduction
משפיע על רבע מיליון אנשים כל שנה, וכתוצאה מכך 180,000 יותר מקרי מוות מדי שנה, קריפטוקוקוס neoformans הוא שמרים פתוגניים, תאיים, סוכן סיבתי של cryptococcosis1,2, 3. שנפגעו הם חולי HIV-חיוביות במדינות עניות שאין להם גישה מוכן לטיפול תרופתי, עושים אותם רגישים בחריפות המחלה4,5,6. נתוני ה-CDC מציינים כי ב אפריקה שמדרום לסהרה, neoformans ג הורג יותר אנשים שחפת מדי שנה, יותר מדי חודש יותר מכל התפרצות אבולה רשומה1. תוואי החשיפה השכיחה ביותר מתרחשת משאיפת נבגים מיובש השגורה הסביבה7. עם כניסתו אל הריאות, ישנם מספר גורמים התקפה אלימה אשר תורמים להצלחת neoformans ג בתוך אנשים נגועים. הקפסולה רב-סוכר נחשבת הגורם של החיידק העיקרי התקפה אלימה, כמו זנים acapsular אינן מידבק8.
הקפסולה cryptococcal מורכבת של שלושה מרכיבים עיקרון: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM), ו- mannoproteins (MPs)9. בעוד MPs הם קלים יחסית רכיב הקשורים דופן התא של הקפסולה, הם immunogenic, יכול לקדם מענה בעיקר פרו דלקתיים9,10. לעומת זאת, GXM ו GalXM לעשות את החלק הארי של הקפסולה (> 90% לפי משקל) ויש תופעות לדיכוי המערכת החיסונית11. בנוסף השפעותיו immunomodulatory, הגדלה מהירה של ה קפסולה ויוו יוצר מחסום מכני בליעה על ידי המארח תאים phagocytic (קרי, נויטרופילים ומקרופגים)12. הקפסולה neoformans ג ו הסינתזה שלו הם מורכבים, אבל באופן כללי, הגדלת קוטר קפסולה הוא מתואם עם התקפה אלימה מוגברת6,13,14. נתון זה, חשוב לחוקרים neoformans ג שניתן יהיה במהירות ובדייקנות לכמת מדידות כמוסה.
תא neoformans ג והן כמוסה רב-סוכר שלה הם מבנים דינמיים ולהראות שינויים לאורך זמן15. הקפסולה יכול שינוי צפיפות, בגודל הרכבה בתגובה לשינויים17,1816,סביבת המחשב המארח. ברזל נמוך או רמות מזין, חשיפה סרום, ה-pH אנושי פיזיולוגי ו CO מוגבר2 ידועים ליזום צמיחה קפסולה16,18,19,20. יתרה מזאת, חוקרים יש הראו שינויים מבניים וכתוצאה מכך הבדלים משמעותיים immunoreactivity במהלך זיהום, ההלוואות יתרון כדי neoformans ג על המארח שלו21,22. דבר זה ידוע כי הארכיטקטורה של הקפסולה neoformans ג נותחה במגוון דרכים. מיקרוסקופ אלקטרונים, לדוגמה, חשפה כי הקפסולה יש מטריצה הטרוגנית עם שכבת צפיפות אלקטרונים הפנימית מתחת לשכבה החיצונית, יותר חדיר23. פיזור אור ושימוש של מלקחיים אופטיים אפשרו החוקרים להבהיר עוד יותר את מאפייני macromolecular24. ניתוח התוצאות של שתי מדידות פיזור אור סטטיים ודינמיים, אנו יודעים כי הקפסולה רב-סוכר יש מורכבות מסעף מבנה23. מלקחיים אופטיים שימשו כדי לבחון את הנוקשות של המבנה, כמו גם להעריך את תגובתיות של נוגדן24. אולם, ניתוח מועסקים לעיתים קרובות ביותר של הקפסולה neoformans ג הוא מידת גודלו.
כדי לכמת את גודל קפסולה, חוקרים משתמשים מה צריך להיות מדידה פשוטה: הקוטר ליניארי של הקפסולה. מיקרוסקופ דיגיטלי משמשים כדי ללכוד תמונות של neoformans ג מספר תאים (בדרך כלל מאות) צבעונית עם דיו הודו או צבעי פלורסנט. הגודל של כל תא בגוף, כמוסה שמסביב נמדד. הנתונים נאספים, קוטר ממוצע של הקפסולה מחושבת על-ידי חיסור הקוטר לגוף התא של הקוטר התא כולו (תאי גוף + כמוסה). עד לנקודה זו, מדידות אלה נעשו באופן ידני. בעוד בדרך כלל מדויק, בשיטה זו יש חסרונות לחוקרים. ערכות נתונים גדולות יכול לקחת ימים או אפילו שבועות כדי לנתח באופן ידני. כי מדידות אלה נעשים באופן ידני, סובייקטיביות, טעות אנוש משפיעה על התוצאה.
ניתוח אוטומטיות תמונות חישובית הפך כלי הכרחי עבור חוקרים בתחומים רבים של ביולוגיה מולקולרית של התא, המאפשר ניתוח מהיר ואמין יותר של תמונות ביולוגי 25,26,27. טכניקות ניתוח תמונה מדויקת יש צורך לכרות כמותיים של מה הם לעיתים קרובות ערכות נתונים מורכב ועמוק. עם זאת, כמה מדידות, במיוחד את המדידה של הקפסולה ג neoformans , היה קשה להפוך לאוטומטי. זיהוי במדויק את הממשק בין התא לבין קפסולה, אשר בדרך כלל מופיע כעיגול כהה כאשר צילמו על ידי מיקרוסקופ שלב-ניגודיות, יכול להיות בעייתי לפתור באמצעות סף פשוטה. יתרה מזו, neoformans ג תאים בתרבות נוטים להתאחד ואת פילוח מדויק של התאים הוא הכרחי עבור מדידות מדויקות.
מטרת הפרויקט היתה להמחשת (i) אחד מהפרוטוקולים סטנדרטי עבור אינדוקציה קפסולה ב neoformans ג, (ii) השוואה וחדות אינדיה אינק ולפתח פלורסצנטיות צביעת דגים קפסולת מידות קוטר, (iii) פשוט, שיטות למדידת קוטר הקפסולה באמצעות תמונות של הודו דיו צבעונית תאים באמצעות ניתוח תמונה של התוכנה, ו, (iv) להעריך על יתרונותיה וחסרונותיה של מדידת קוטר קפסולה באופן ידני באמצעות תוכנה אוטומציה. לנו למצוא את זה אחת מהשיטות מכתימים שני, פלורסנט תיוג של דופן התא, כמוסה, בעוד אורכת זמן רב, סיפק את התוצאות הכי עקבי בין ניסויים. עם זאת, שתי השיטות אפשרו לנו להבחין בהצלחה בין מעבדה קלינית neoformans ג זנים מפגין אחר קפסולת גדלים. יתר על כן, הצלחנו להפוך לאוטומטי את המדידה של קוטר קפסולה של הודו דיו צבעונית תמונות גיליתי שזו אלטרנטיבה מעשית מדידה ידנית של הקפסולה.
Protocol
Representative Results
Discussion
במשך עשרות שנים, כבר הקפסולה והמוקד העיקרי של המחקר הן mycologists והן קלינאים מעוניין neoformans ג cryptococcosis בשל תפקידה כגורם מרכזי התקפה אלימה על המחלה. באמצעות מיקרוסקופ כדי למדוד את ההבדלים בגודל קפסולה בין זנים, תחת גידול שונים תנאים יכול לספק מידע חשוב על המחלה ועל התגובות לגירויים שונים (<em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לתוכנית הדוקטורט החיים מולקולרית (MOBI), המחלקה לביולוגיה-התיכון טנסי המדינה האוניברסיטה (MTSU) על מתן המימון למחקר זה. הפרויקט גם מומן בחלקו על ידי מענק לפרויקטים מיוחדים מוענק D.E.N. על ידי קרן MTSU.
Materials
| Capsule Induction | |||
| C. neoformans cells | The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University). The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). | ||
| Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O) | ||
| DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | |
| 6-well plates | Falcon | CL5335-5EA | |
| Shaking incubator | Thermo Scientific | MaxQ6000 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | Isotemp | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Legend XTR | |
| Staining | |||
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Legend Micro 21R | |
| India ink | Fisher Scientific | 14-910-56 | |
| Calcofluor white | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| 18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 | A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) | ||
| PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) | PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized. | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Glass coverslips | Corning | 2855-18 | #1.5 thickness |
| Clear nail polish or other non-toxic sealant | |||
| Image Acquisition | |||
| Immersion oil | Cargille | 16484 | |
| Light microscope with immersion oil objective | Zeiss | Zeiss Axio A1 with a Plan – NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective | |
| Light microscope camera | Zeiss | Zeiss Axiocam ErCD camera | |
| Confocal microscope with oil immersion objective | Zeiss | LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. | |
| Confocal microscope software | Zen 2009 | ||
| Confocal microscope camera | Nikon | Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. | |
| Widefield imaging software | Nikon Elements (Nikon) | ||
| Capsule Measurement | |||
| Image editing software | Photoshop (Adobe) | ||
| Microscope software for manual measurement | Axiovision (Carl Zeiss) | ||
| Image analysis software for automated meesurement | Aivia (DRVision Technologies) | ||
| Spreadsheet software | Excel (Microsoft) |
References
- Park, B. J., et al. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
- Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The intracellular life of Cryptococcus neoformans. Annu Rev Pathol. 9, 219-238 (2014).
- Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. Lancet Infect Dis. 17 (8), 873-881 (2017).
- Limper, A. H., Adenis, A., Le, T., Harrison, T. S. Fungal infections in HIV/AIDS. Lancet Infect Dis. 17 (11), e334-e343 (2017).
- Casadevall, A. Crisis in Infectious Diseases: 2 Decades Later. Clin Infect Dis. 64 (7), 823-828 (2017).
- McClelland, E. E. C., Eisenmann, A., H, Ch 6. New Insights in Medical Mycology. , 131-157 (2007).
- Leopold Wager, C. M., Wormley, F. L. Classical versus alternative macrophage activation: the Ying and the Yang in host defense against pulmonary fungal infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1023-1035 (2014).
- Kwon-Chung, K. J., Rhodes, J. C. Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans. Infect Immun. 51 (1), 218-223 (1986).
- Vecchiarelli, A., et al. Elucidating the immunological function of the Cryptococcus neoformans capsule. Future Microbiol. 8 (9), 1107-1116 (2013).
- Murphy, J. W. Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity. Rev Infect Dis. 10 Suppl 2, S432-S435 (1988).
- Cherniak, R., Morris, L. C., Belay, T., Spitzer, E. D., Casadevall, A. Variation in the structure of glucuronoxylomannan in isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis. Infect Immun. 63 (5), 1899-1905 (1995).
- Collins, H. L., Bancroft, G. J. Encapsulation of Cryptococcus neoformans impairs antigen-specific T-cell responses. Infect Immun. 59 (11), 3883-3888 (1991).
- Yasuoka, A., Kohno, S., Yamada, H., Kaku, M., Koga, H. Influence of molecular sizes of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide on phagocytosis. Microbiol Immunol. 38 (11), 851-856 (1994).
- Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans ex vivo capsule size is associated with intracranial pressure and host immune response in HIV-associated cryptococcal meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
- Cordero, R. J., Bergman, A., Casadevall, A. Temporal behavior of capsule enlargement by Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 12 (10), 1383-1388 (2013).
- O’Meara, T. R., Alspaugh, J. A. The Cryptococcus neoformans capsule: a sword and a shield. Clin Microbiol Rev. 25 (3), 387-408 (2012).
- McClelland, E. E., Smith, J. M. Gender specific differences in the immune response to infection. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 59 (3), (2011).
- McClelland, E. E., Perrine, W. T., Potts, W. K., Casadevall, A. Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines. Infect Immun. 73 (10), 7047-7050 (2005).
- Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and CO(2). Infect Immun. 71 (1), 6155-6164 (2003).
- Vartivarian, S. E., et al. Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron. J Infect Dis. 167 (1), 186-190 (1993).
- McFadden, D. C., Fries, B. C., Wang, F., Casadevall, A. Capsule structural heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 6 (8), 1464-1473 (2007).
- Garcia-Hermoso, D., Dromer, F., Janbon, G. Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection. Infect Immun. 72 (6), 3359-3365 (2004).
- Gates, M. A., Thorkildson, P., Kozel, T. R. Molecular architecture of the Cryptococcus neoformans capsule. Mol Microbiol. 52 (1), 13-24 (2004).
- Pontes, B., Frases, S. The Cryptococcus neoformans capsule: lessons from the use of optical tweezers and other biophysical tools. Front Microbiol. 6, 640 (2015).
- Shen, H., et al. Automated tracking of gene expression in individual cells and cell compartments. J R Soc Interface. 3 (11), 787-794 (2006).
- Dorn, J. F., Danuser, G., Yang, G. Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data. Methods Cell Biol. 85, 497-538 (2008).
- Nketia, T. A., Sailem, H., Rohde, G., Machiraju, R., Rittscher, J. Analysis of live cell images: Methods, tools and opportunities. Methods. , 65-79 (2017).
- . . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 33-38 (2015).
- Kwon, O., Kang, S. T., Kim, S. H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping. J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).
- Janbon, G., et al. Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation. PLoS Genet. 10 (4), e1004261 (2014).
- Bisson, G. P., et al. The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana. J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).
- van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study. Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).
- Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).
