Química la amputación y la regeneración de la faringe en el Planarian Schmidtea mediterranea
Summary
El planarian Schmidtea mediterranea es un excelente modelo para estudiar las células madre y regeneración de los tejidos. Esta publicación describe un método para eliminar selectivamente un órgano, la faringe, por la observación de animales de la azida de sodio químicos. Este protocolo también describe métodos para el monitoreo de la regeneración de la faringe.
Abstract
Planarias son gusanos planos que son muy eficientes en la regeneración. Deben esta capacidad a un gran número de células madre que pueden responder rápidamente a cualquier tipo de lesión. Modelos de lesiones comunes en estos animales eliminar grandes cantidades de tejido, lo cual daña múltiples órganos. Para superar el daño de tejido amplia, se describe aquí un método para eliminar selectivamente un único órgano, la faringe, en el planarian Schmidtea mediterranea. Logramos esto por los animales remojo en una solución que contiene la azida de sodio inhibidor de la citocromo oxidasa. Breve exposición a azida de sodio provoca la protuberancia de la faringe del animal, que llamamos “química amputación.” Química amputación elimina la faringe entera y genera una pequeña herida en la faringe se fija al intestino. Después de lavado amplia, todos los animales amputados regeneran una faringe completamente funcional en aproximadamente una semana. En el resto de la regeneración de la unidad de cuerpo de la faringe nuevas células. Presentamos un detallado protocolo de amputación química y describir los métodos histológicos y de comportamiento para evaluar éxito amputación y regeneración.
Introduction
La regeneración es un fenómeno que ocurre en todo el reino animal, con capacidad regenerativa de la regeneración de todo el cuerpo de ciertos invertebrados a más facultades en vertebrados1. Sustitución de tejido funcional es un proceso complejo y a menudo implica la restauración simultánea de múltiples tipos de células. Por ejemplo regenerar el miembro de Salamandra, osteoblastos, condrocitos, neuronas, músculos y células epiteliales deben ser reemplazado2. Estos tipos de celda recién generado también tiene que organizarse adecuadamente para facilitar la nueva función del miembro. Comprensión de estos procesos complejos requiere de técnicas que se centran en la regeneración de tipos celulares específicos y su integración en órganos.
Una de las estrategias empleadas para simplificar el estudio de la respuesta regenerativa es la ablación dirigida de ciertos tipos celulares o colecciones más grandes de los tejidos. Por ejemplo, en el pez cebra, expresión de nitroreductase en tipos celulares específicos conduce a su destrucción después de la aplicación de metronidazol3,4. En larvas de Drosophila , expresando genes pro-apoptosis en promotores específicos de tejido selectivamente puede ablar regiones específicas del disco imaginal5,6. Dos de estas estrategias dañar rápido pero controlado y han sido utilizados para diseccionar los mecanismos moleculares y celulares para la regeneración.
En este manuscrito, se describe un método para extirpar selectivamente un órgano entero llamado la faringe en el planarian Schmidtea mediterranea. Planarias son un modelo clásico de la regeneración, conocido por su prolífica capacidad regenerativa, donde fragmentos incluso minutos pueden volver a crecer todo animales de 7,8. Tienen una población grande y heterogénea de las células madre de células pluripotentes y progenitores de linaje restringido9,10,11. Estas células proliferan y diferencian para reemplazar todos los tejidos faltantes, incluyendo la faringe, sistemas nerviosos, digestivos y excretorios y músculo y las células epiteliales9,10,12. Si bien sabemos que estas células madre iniciar la regeneración, no comprendemos plenamente los mecanismos moleculares que conducen a sustituir todos estos diferentes tipos de células. Definidos métodos heridos que provocan respuestas precisas células madre pueden ayudar a delinear este complejo proceso.
La faringe es un tubo cilíndrico, grande necesario para la alimentación y contiene neuronas, músculo, células epiteliales y secreción13,29. Normalmente oculto en una bolsa en la parte ventral del animal, se extiende por el cuerpo del animal una apertura sobre la detección de la presencia de alimentos. Para amputar selectivamente la faringe, remojan planarias en un químico llamado sódica, un anestésico utilizado en C. elegans14,15,16. Su uso en planarias primero fue divulgado por Adler et al., en el 201412. A minutos de exposición a la azida sódica, planarias sacan su musculo y con suave agitación, se separa la faringe del animal. Nos referimos a esta pérdida selectiva y completa de la faringe como “amputación química”. Una semana después de la amputación, una faringe completamente funcional es restaurado12. Ya que la faringe se requiere para la alimentación, regeneración funcional puede medirse mediante el control de comportamiento de alimentación. A continuación, se describe el protocolo para amputación química y para evaluar la regeneración de la faringe y la restauración del comportamiento alimentario.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un método de ablación selectiva de la faringe con azida de sodio. Otros estudios de ablación dirigida en planarias han utilizado cirugía modificada para eliminar fotorreceptores21 o tratamiento farmacológico a la ablación de las neuronas dopaminérgicas22. Una ventaja importante de amputación química sobre los métodos existentes es que no requiere cirugía. La estructura rígida de la faringe en comparación con el resto del cuerpo planarian…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Alejandro Sánchez Alvarado, quien apoyó la optimización inicial y el desarrollo de esta técnica. Trabajo en laboratorio de Carolyn Adler está financiado por fondos de puesta en marcha de la Universidad de Cornell.
Materials
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Chemical | C79-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | Fisher Chemical | M65-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuïc salt solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Acros Organics/VWR | 196770010 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Chloride (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuïc salt solution |
| Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | Storing planaria water |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands | Amazon | Planaria water |
| Gentamicin Sulfate | Gemini Bio-products | 400-100P | Planaria water |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Mincing liver |
| Disposable pastry bags-16”, 12 pack | Wilton | Amazon | Liver aliquots |
| 5 mL syringes | BD/VWR | 309647 | Liver aliquots |
| Petri dishes-35mm/60mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
| Plastic containers (various sizes) | Ziploc | Amazon | Housing planarians in static culture |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Transfer pipette | Globe Scientific | 138030 | |
| Forceps – Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D (0203-5-PO) | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 |
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