الكيميائية البتر والتجديد البلعوم في البلاناريا mediterranea شميدتيا
Summary
البلاناريا mediterranea شميدتيا نموذج ممتاز لدراسة الخلايا الجذعية وتجديد الأنسجة. ويصف هذا المنشور أسلوب لإزالة جهاز واحد، البلعوم، بشكل انتقائي بتعريض الحيوانات لأزيد الصوديوم الكيميائية. ويوجز هذا البروتوكول أيضا أساليب لرصد التجديد البلعوم.
Abstract
بلاناريانس هي فلاتورمس التي فعالة للغاية في التجديد. أنهم مدينون بهذه القدرة على عدد كبير من الخلايا الجذعية التي يمكن الاستجابة بسرعة لأي نوع من الضرر. نماذج الإصابات الشائعة في هذه الحيوانات إزالة كميات كبيرة من الأنسجة، مما يضر بأجهزة متعددة. للتغلب على هذه الأضرار الأنسجة واسعة، يصف لنا هنا طريقة لإزالة جهاز واحد، البلعوم، بشكل انتقائي في البلاناريا mediterranea شميدتيا. نحقق ذلك بالحيوانات مغطس بمحلول يحتوي على أزيد الصوديوم مثبطات السيتوكروم أوكسيديز. تعرض موجزاً لأزيد الصوديوم يسبب بثق البلعوم من الحيوان، والتي نسميها “الكيميائية البتر.” بتر الكيميائية يزيل البلعوم كامل، ويولد جرحا صغيراً حيث تولي البلعوم للامعاء. وبعد الشطف واسعة النطاق، تجديد جميع الحيوانات المبتورة البلعوم تعمل بكامل طاقتها في أسبوع واحد تقريبا. الخلايا الجذعية في بقية أنحاء الجسم محرك التجديد البلعوم الجديدة. هنا، نحن نقدم مفصل البروتوكول لبتر الكيميائية، ووصف طرق غذائها والسلوكية على السواء لتقييم نجاح البتر والتجديد.
Introduction
التجديد هو ظاهرة تحدث في جميع أنحاء المملكة الحيوانية، مع قدرات التجدد بدءاً من تجديد كامل الجسم في بعض اللافقاريات إلى قدرات أكثر تقييداً في الفقاريات1. استبدال أنسجة وظيفية عملية معقدة، وكثيراً ما يستتبع إعادة متزامنة بأنواع متعددة من الخلايا. على سبيل المثال، تجديد أطرافهم [سلمندر]، خلايا الاوستيوبلاستس، chondrocytes، والخلايا العصبية، والعضلات، والخلايا الظهارية في حاجة إلى أن يكون محل2. هذه أنواع الخلايا التي تم إنشاؤها حديثا تحتاج أيضا إلى أن تنظم بشكل صحيح لتيسير وظيفة جديدة من أطرافهم. فهم هذه العمليات المعقدة تتطلب التقنيات التي تركز على التجديد لأنواع محددة من الخلايا واندماجها في الأجهزة.
واحدة من الاستراتيجيات المستخدمة لتبسيط دراسة استجابات التجدد هو الاجتثاث المستهدفة أما بعض أنواع الخلايا أو مجموعات أكبر من الأنسجة. على سبيل المثال، في الزرد، التعبير عن نيتروريدوكتاسي في أنواع محددة من الخلايا يؤدي إلى تدميرها بعد تطبيق ميترونيدازول3،4. في اليرقات المورفولوجية ، يمكن التعبير عن الجينات برو-أبوبتوتيك تحت المروجين الأنسجة على حدة بشكل انتقائي يجتذ مناطق محددة من5،إيماجينال القرص6. كل من هذه الاستراتيجيات تسبب التلف السريع الخاضعة للرقابة، وقد استخدمت لتشريح الآليات الجزيئية والخلوية المسؤولة عن التجدد.
في هذه المخطوطة، يمكننا وصف أسلوب انتقائي يجتذ جهازا أسرة تسمى البلعوم في البلاناريا mediterranea شميدتيا. بلاناريانس نموذج كلاسيكية للتجدد، معروفة بقدرتها التجدد غزير، حيث يمكن أن تنمو شظايا دقيقة حتى الحيوانات كله 7،8. لديهم عدد سكانها كبيرة وغير متجانسة من الخلايا الجذعية تتكون من خلايا pluripotent وفروعه المقيدة بالنسب9،،من1011. تتكاثر هذه الخلايا والتفريق ليحل محل جميع الأنسجة المفقودين، بما في ذلك البلعوم ونظم الجهاز العصبي والجهاز الهضمي والإخراج، والعضلات والخلايا الظهارية9،،من1012. وفي حين أننا نعرف أن هذه الخلايا الجذعية الشروع في التجديد، نحن لا يفهم تماما الآليات الجزيئية التي تدفع بهم استبدال كل هذه الأنواع المختلفة من الخلية. يمكن أن تساعد الأساليب مما أسفر عن إصابة محددة بأن الحصول على ردود محددة من الخلايا الجذعية تحدد هذه العملية المعقدة.
البلعوم عبارة عن أنبوب أسطواني كبير، واللازمة لتغذية، ويحتوي على الخلايا العصبية، والعضلية، والخلايا الظهارية والافرازيه13،29. عادة مخبأة في حقيبة على الجانب البطني للحيوان، فهي تمتد من خلال جسم الحيوان واحد فتح عند استشعار وجود الغذاء. إلى بتر البلعوم بشكل انتقائي، ونحن نقع بلاناريانس في أزيد صوديوم تسمى كيميائية، مخدر استخداماً في C. ايليجانس14،،من1516. استخدامها في بلاناريانس وأبلغت أولاً أدلر et al.، في عام 201412. في غضون دقائق تعرض لأزيد الصوديوم، بلاناريانس قذف بهم فارينجيس، ويفصل البلعوم مع الانفعالات لطيف، من الحيوان. نشير إلى هذه الخسارة كاملة وانتقائية البلعوم ك “بتر الكيميائية”. أسبوع واحد بعد بتر الأطراف، البلعوم تعمل بكامل طاقتها هو استعادة12. لأن البلعوم مطلوب للتغذية، يمكن قياس التجدد الوظيفية برصد سلوك التغذية. أدناه، ونحن تصف البروتوكول لبتر الكيميائية، وتقييم تجديد البلعوم وإعادة تغذية السلوك.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف هذا البروتوكول طريقة التذرية انتقائية البلعوم باستخدام أزيد الصوديوم. استخدمت دراسات أخرى الاجتثاث المستهدفة في بلاناريانس تعديل عملية جراحية لإزالة photoreceptors21 أو العلاج الدوائي ليجتذ تتميز الخلايا العصبية22. واحد ميزة هامة من بتر الكيميائية عبر الطرق الحا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر أليخاندرو سانشيز ألفارادو، الذين أيدوا في التحسين الأولية وتطوير هذه التقنية. العمل في مختبر كارولين أدلر معتمد من قبل جامعة كورنيل أموال بدء التشغيل.
Materials
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Chemical | C79-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | Fisher Chemical | M65-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuïc salt solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Acros Organics/VWR | 196770010 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Chloride (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuïc salt solution |
| Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | Storing planaria water |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands | Amazon | Planaria water |
| Gentamicin Sulfate | Gemini Bio-products | 400-100P | Planaria water |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Mincing liver |
| Disposable pastry bags-16”, 12 pack | Wilton | Amazon | Liver aliquots |
| 5 mL syringes | BD/VWR | 309647 | Liver aliquots |
| Petri dishes-35mm/60mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
| Plastic containers (various sizes) | Ziploc | Amazon | Housing planarians in static culture |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Transfer pipette | Globe Scientific | 138030 | |
| Forceps – Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D (0203-5-PO) | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 |
References
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).
- Tanaka, E. M. The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration. Cell. 165, 1598-1608 (2016).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat. Protoc. 3, 948-954 (2008).
- White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62, 232-240 (2013).
- Smith-Bolton, R. K., Worley, M. I., Kanda, H., Hariharan, I. K. Regenerative growth in Drosophila imaginal discs is regulated by Wingless and Myc. Dev. Cell. 16, 797-809 (2009).
- Smith-Bolton, R. Drosophila Imaginal Discs as a Model of Epithelial Wound Repair and Regeneration. Adv. Wound Care. 5, 251-261 (2016).
- Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Not your father’s planarian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat. Rev. Genet. 3, 210-219 (2002).
- Reddien, P. W., Sánchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725-757 (2004).
- Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
- Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea. Stem Cell Reports. 3, 339-352 (2014).
- van Wolfswinkel, J. C., Wagner, D. E., Reddien, P. W. Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment. Cell Stem Cell. 15, 326-339 (2014).
- Adler, C. E., Seidel, C. W., McKinney, S. A., Sánchez Alvarado, A. Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria. Elife. 3, e02238 (2014).
- Adler, C. E., Sánchez Alvarado, A. PHRED-1 is a divergent neurexin-1 homolog that organizes muscle fibers and patterns organs during regeneration. Dev. Biol. 427, 165-175 (2017).
- Wong, M. C., Martynovsky, M., Schwarzbauer, J. E. Analysis of cell migration using Caenorhabditis elegans as a model system. Methods Mol. Biol. 769, 233-247 (2011).
- Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C elegans chemotaxis assay. J. Vis. Exp. , e50069 (2013).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177 (2012).
- Tasaki, J., Uchiyama-Tasaki, C., Rouhana, L. Analysis of Stem Cell Motility In Vivo Based on Immunodetection of Planarian Neoblasts and Tracing of BrdU-Labeled Cells After Partial Irradiation. Methods Mol. Biol. 1365, 323-338 (2016).
- Roberts-Galbraith, R. H., Brubacher, J. L., Newmark, P. A. A functional genomics screen in planarians reveals regulators of whole-brain regeneration. Elife. 5, (2016).
- Arnold, C. P., et al. Pathogenic shifts in endogenous microbiota impede tissue regeneration via distinct activation of TAK1/MKK/p38. Elife. 5, (2016).
- Pearson, B. J., et al. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
- LoCascio, S. A., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Eye Absence Does Not Regulate Planarian Stem Cells during Eye Regeneration. Dev. Cell. 40, 381-391 (2017).
- Nishimura, K., et al. Regeneration of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine-induced lesion in planarian brain. J. Neurochem. 119, 1217-1231 (2011).
- Wilson, D. F., Chance, B. Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation. Biochim. Biophys. Acta. 131, 421-430 (1967).
- Duncan, H. M., Mackler, B. Electron Transport Systems of Yeast: III. Preparation and properties of cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 241, 1694-1697 (1966).
- Buchan, J. R., Yoon, J. H., Parker, R. Stress-specific composition, assembly and kinetics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 228-239 (2011).
- Cebrià, F. Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: An immunocytochemical study. Neurosci. Res. 61, 375-384 (2008).
- Shimoyama, S., Inoue, T., Kashima, M., Agata, K. Multiple Neuropeptide-Coding Genes Involved in Planarian Pharynx Extension. Zoolog. Sci. 33, 311-319 (2016).
- Ito, H., Saito, Y., Watanabe, K., Orii, H. Epimorphic regeneration of the distal part of the planarian pharynx. Dev. Genes Evol. 211, 2-9 (2001).
- Bueno, D., Espinosa, L., Baguñà, J., Romero, R. Planarian pharynx regeneration in tail fragments monitored with cell-specific monoclonal antibodies. Dev. Genes Evol. 206, 425-434 (1997).
- Hyman, L. . The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. , (1951).
