Chimica l'amputazione e la rigenerazione della faringe nella Planaria planarie mediterranea
Summary
La planaria planarie mediterranea è un eccellente modello per studiare le cellule staminali e rigenerazione dei tessuti. Questa pubblicazione descrive un metodo per rimuovere selettivamente un solo organo, la faringe, esponendo gli animali per la chimica sodio azide. Questo protocollo delinea anche metodi per il monitoraggio di rigenerazione della faringe.
Abstract
Planarie sono vermi piatti che sono estremamente efficienti in rigenerazione. Devono questa capacità di un gran numero di cellule staminali che possono rispondere rapidamente a qualsiasi tipo di ferita. Modelli di lesione comune in questi animali rimuovono grandi quantità di tessuto, che danneggia gli organi multipli. Per superare questo danno di tessuto ampio, descriviamo qui un metodo per rimuovere in modo selettivo un singolo organo, la faringe, in Planaria planarie mediterranea. Raggiungiamo questo dagli animali ammollo in una soluzione contenente l’azoturo di sodio inibitore dell’ossidasi del citocromo. Breve esposizione al sodio azide provoca estrusione della faringe dall’animale, che noi chiamiamo “amputazione chimica.” Amputazione chimica rimuove l’intera faringe e genera una piccola ferita, dove la faringe si attacca all’intestino. Dopo il risciacquo vasto, tutti gli animali amputati rigenerano una faringe completamente funzionale in circa una settimana. Cellule staminali nel resto del corpo di auto rigenerazione della faringe nuova. Qui, forniamo un dettagliato protocollo per amputazione chimica e descrivere i metodi sia istologici e comportamentali per valutare il successo amputazione e rigenerazione.
Introduction
La rigenerazione è un fenomeno che si verifica in tutto il Regno animale, con capacità rigenerative che vanno dalla rigenerazione di corpo pieno in alcuni invertebrati a più limitate capacità in vertebrati1. Sostituzione dei tessuti funzionali è un processo complesso e spesso comporta il ripristino simultaneo di più tipi di cellule. Ad esempio, per rigenerare l’arto di Salamandra, osteoblasti, condrociti, neuroni, muscoli e cellule epiteliali c’è bisogno di essere sostituito2. Questi tipi di cellule appena generato anche bisogno di essere organizzato correttamente per facilitare la nuova funzione dell’arto. Comprensione di tali processi complessi richiede tecniche che si concentrano sulla rigenerazione di tipi cellulari specifici e la loro integrazione negli organi.
Una delle strategie impiegate per semplificare lo studio della risposta rigenerativa è l’ablazione mirata di alcuni tipi di cellule o di più grandi collezioni di tessuti. Ad esempio, in zebrafish, espressione di nitroreductase in tipi cellulari specifici conduce alla loro distruzione dopo l’applicazione di metronidazole3,4. Nelle larve di Drosophila , espressione dei geni pro-apoptotici sotto promotori tessuto-specifici possono selettivamente l’ablazione regioni specifiche del disco immaginale5,6. Entrambe queste strategie causare danni rapido ma controllato e sono state utilizzate per analizzare i meccanismi molecolari e cellulari responsabili di rigenerazione.
In questo manoscritto, descriviamo un metodo per rimuovere in modo selettivo un intero organo chiamato faringe in Planaria planarie mediterranea. Planarie sono un classico modello di rigenerazione, noto per la loro capacità rigenerativa prolifico, dove anche minuscoli frammenti possono ricrescere interi animali 7,8. Hanno una grande, eterogenea popolazione di cellule staminali che consiste di cellule pluripotenti e di progenitori lignaggio-limitata9,10,11. Queste cellule proliferano e si differenziano per sostituire tutti i tessuti mancanti, tra cui il faringe, sistema nervoso, apparato digerente ed escretore e muscolo e cellule epiteliali9,10,12. Mentre sappiamo che queste cellule staminali iniziare la rigenerazione, non comprendiamo pienamente i meccanismi molecolari che guidano loro di sostituire tutti questi tipi differenti delle cellule. Metodi definiti ferentesi che suscitano le risposte precise sulle cellule staminali possono aiutare a delineare questo complesso processo.
La faringe è un tubo grande, cilindrico, necessario per l’alimentazione e contiene neuroni, muscolo, cellule epiteliali e secretiva13,29. Normalmente nascosti in una tasca sul lato ventrale dell’animale, si estende attraverso il corpo dell’animale singolo apertura su sentendo la presenza di cibo. Per selettivamente amputare la faringe, siamo ammollo planarie in una chimico chiamato sodio azide, un anestetico usato comunemente in c. elegans14,15,16. Suo uso in planarie in primo luogo è stato segnalato da Adler et al., nel 201412. In pochi minuti di esposizione al sodio azide, planarie estrudere loro pharynges, e con agitazione delicata, la faringe si stacca dall’animale. Ci riferiamo a questa perdita completa e selettiva della faringe come “chimica amputazione”. Una settimana dopo l’amputazione, una faringe completamente funzionale è restaurato12. Poiché la faringe è necessaria per l’alimentazione, rigenerazione funzionale può essere misurata monitorando il comportamento alimentare. Di seguito descriviamo il protocollo per l’amputazione di chimica e valutare la riqualificazione della faringe e del comportamento alimentare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo di ablazione selettiva della faringe utilizzando sodio azide. Altri studi di ablazione mirati in planarie hanno utilizzato modificata chirurgia per rimuovere fotorecettori21 o trattamento farmacologico per l’ablazione di neuroni dopaminergici22. Un vantaggio significativo di amputazione chimico rispetto ai metodi esistenti è che non richiede intervento chirurgico. La struttura rigida della faringe rispetto al resto del corpo Planaria fa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Alejandro Sánchez Alvarado, che hanno sostenuto l’ottimizzazione iniziale e lo sviluppo di questa tecnica. Lavoro in laboratorio di Carolyn Adler è sostenuta da fondi di Start-up di Cornell University.
Materials
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Chemical | C79-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | Fisher Chemical | M65-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuïc salt solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Acros Organics/VWR | 196770010 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Chloride (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuïc salt solution |
| Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | Storing planaria water |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands | Amazon | Planaria water |
| Gentamicin Sulfate | Gemini Bio-products | 400-100P | Planaria water |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Mincing liver |
| Disposable pastry bags-16”, 12 pack | Wilton | Amazon | Liver aliquots |
| 5 mL syringes | BD/VWR | 309647 | Liver aliquots |
| Petri dishes-35mm/60mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
| Plastic containers (various sizes) | Ziploc | Amazon | Housing planarians in static culture |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Transfer pipette | Globe Scientific | 138030 | |
| Forceps – Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D (0203-5-PO) | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 |
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