Chemische amputatie en regeneratie van de keelholte in de Planarian Schmidtea mediterranea

Regeneratie is een verschijnsel dat zich voordoet in het dierenrijk, met regeneratieve capaciteiten van volledige lichaam regeneratie in bepaalde ongewervelde dieren tot meer beperkte capaciteiten in gewervelde dieren¹. Vervanging van functionele weefsels is een complex proces en vaak met zich meebrengt het gelijktijdige herstel van meerdere celtypen. Bijvoorbeeld om te regenereren de salamander ledemaat, botcellen chondrocyten, neuronen, spieren en epitheliale cellen moeten worden vervangen². Deze nieuw gegenereerde celtypes moeten ook goed worden georganiseerd om nieuwe functie van de ledematen. Inzicht in deze complexe processen vereist technieken die gericht zijn op herstel van bepaalde celtypen en hun integratie in de organen.

Een van de strategieën ter vereenvoudiging van de studie van regeneratieve reacties in dienst is de gerichte ablatie van hetzij bepaalde celtypen of grotere collecties van weefsels. Bijvoorbeeld, in zebrafish leidt uitdrukking van nitroreductase in specifieke celtypen tot hun vernietiging na toepassing van metronidazol^3,4. In Drosophila larven, het uiten van pro-apoptotic genen onder weefsel-specifieke initiatiefnemers bepaalde regio’s van de imaginaire schijf^5,6selectief lasertherapie. Beide van deze strategieën snelle, maar gecontroleerde schade veroorzaken, en zijn gebruikt voor het ontleden van de moleculaire en cellulaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de regeneratie.

In dit manuscript beschrijven we een methode voor selectief lasertherapie een gehele orgaan de farynx in de planarian Schmidtea mediterraneagenoemd. Planarians zijn een klassieke model van regeneratie, bekend voor hun productieve regeneratieve vermogen, waar zelfs minieme fragmenten kunnen regrow hele dieren ^7,8. Ze hebben een grote, heterogene populatie van stamcellen uit zowel pluripotente cellen en lineage-beperkte progenitoren^9,10,11. Deze cellen vermenigvuldigen en onderscheid maken ter vervanging van alle ontbrekende weefsel, met inbegrip van de keelholte, zenuwachtig, spijsvertering en uitscheidingsmechanisme systemen, en spier- en epitheliale cellen^9,10,12. Terwijl we weten dat deze stamcellen regeneratie start, doen we de moleculaire mechanismen die hen ter vervanging van al deze verschillende soorten cellen rijden niet volledig begrijpen. Gedefinieerde verwonden methoden die de cel van de stam van de precieze antwoorden ontlokken kunnen helpen dit complexe proces af te bakenen.

De keelholte is een grote, cilindervormige buis die nodig zijn voor het voederen en neuronen, spier, epitheliale en secretoire cellen^13,29bevat. Normaal gesproken verborgen in een tasje aan de ventrale zijde van het dier, het strekt zich uit door één lichaam van het dier openen na detectie van de aanwezigheid van voedsel. Om selectief amputeren de farynx, genieten we planarians in een chemische genaamd natriumazide, een veelgebruikte verdoving in C. elegans^14,15,16. Het gebruik ervan in planarians werd voor het eerst gemeld door Adler et al.., in 2014¹². Binnen enkele minuten van de blootstelling aan natriumazide planarians extruderen hun pharynges, en met zachte agitatie, de keelholte is losgekoppeld van het dier. We verwijzen naar dit complete en selectieve verlies van de keelholte als “chemische amputatie”. Een week na amputatie, is een volledig functionele farynx gerestaureerde¹². Omdat de farynx vereist wordt voor het voederen, kan functionele regeneratie worden gemeten door voeding werking te controleren. Hieronder beschrijven we het protocol voor chemische amputatie, en voor de beoordeling van de regeneratie van de farynx en restauratie van het voederen van gedrag.