Summary

Zygotic 형광 복구 사진 표백 후 전체 기간 개발을 허용 하는 Chromatin 풀림에 대 한 분석

Published: June 12, 2018
doi:

Summary

Chromatin 설사 blastomeres의 발달 잠재력에 관련 된 것 처럼 보인다. 그러나, 그것은 알 수 없습니다 여부 chromatin 설사 배아에 대 한 발달 잠재력에 대 한 신뢰할 수 있는 인덱스로 사용할 수 있습니다. 여기, chromatin 설사 평가 zygotes 만기를 개발할 수 있는 실험 시스템 설명 하고있다.

Abstract

라이브 영상 ontogenesis 동안 분자 이벤트의 분석을 허용 하는 강력한 도구입니다. 최근, chromatin 풀림 또는 개방 만능 배아 줄기 세포의 세포질 감 별 법 잠재력에 포함 될 표시 되었습니다. 그것은 이전에 비해 알려졌다 배아 줄기 세포와 zygotes 항구 그들의 totipotency와의 연결을 제안 하는 매우 느슨하게 chromatin 구조를. 그러나, 지금까지 그것은 되지 해결 되었습니다이 매우 느슨하게/오픈 chromatin 구조 배아 발달 잠재력에 대 한 중요 한 인지. 현재 연구에서이 가설을 시험 하는 실험 시스템 형광에 의해 분석 된 어떤 zygotes 사진 표백 후 복구 기간 어떤 뜻깊은 손상도 없이 개발할 수 있는 개발 되었다. 중요 한 것은,이 실험적인 시스템만 보온병 플레이트 히터 confocal 레이저 스캐닝 현미경 이외에 필요 합니다. 이 연구의 결과 분석 (FRAP) 분석 사진 표백 zygotic chromatin에서 분자 이벤트 전체 기간 개발에 대 한 중요 한 인지 조사를 사용할 수 있는 후 그 형광 복구를 좋습니다.

Introduction

수정, 후 염색 질 구조를 동적으로 변경 하 고 zygotic 염색 질 구조는 다음 결국 설립된1,2. 아버지 pronuclei에이 기간 동안 지배적인 chromatin 단백질 히스톤으로 protamine에서 변경 됩니다. 결과 chromatin sperms와 몇 가지 포인트 (, 히스톤 변형 구성, 히스톤 수정) 여성 oocytes에서 매우 다르다. 따라서, 형성된 zygotic chromatin 이후의 배아 발달에 대 한 중요 한 것으로 생각 된다. 그러나, 오랜 기간 동안 zygotic chromatin 구조의 세부 정보를 공개 하는 노력에 불구 하 고 방법을 zygotes의 품질을 평가 하거나 1 셀 단계에서 그들의 전체-용어 개발의 염색 질 구조를 분석 하 여 예측 하는 적 설립.

이전 연구에서 그것은 발견을 zygotes 매우 느슨하게 chromatin 구조3. 현재, chromatin 풀림 또는 개방 세포 분화 배아 줄기 (ES) 세포4잠재력에 대 한 중요 한 요소가 될 여겨진다. ES 세포 자연, 동질성을 전시 하지 않습니다 하지만 오히려 다른 유형의; ES 세포 식민지, 일부 정도 높은 감 별 법 잠재력 blastomeres 2 셀 단계 배아의 비교를 획득. 상태 처럼 2 셀으로이 전환 중 ES에서 chromatin 설사 2 세포 단계 태아5와 비교에 변화 세포. 따라서, chromatin 설사 세포질 감 별 법 잠재력과 그것은 가능한 광범위 하 게 chromatin zygotes에서 열리는 중요 한 것 zygotic 개발 잠재력의 평가 위해 유용 하는 것 같다.

라이브 영상 때문에이 메서드는 후속 개발 및도 전체 용어 개발6수 있습니다 ontogenesis 동안 분자 이벤트의 분석을 허용 하는 강력한 도구입니다. 라이브 이미징 방법 중 하나로 FRAP 분석 preimplantation 배아와 ES 세포3,,45chromatin 설사 검사를 사용 되었습니다. Zygotic chromatin 설사 FRAP 분석 개발 전체-용어에 해로운 효과 없이 분석할 수 있습니다, 만약 1 셀 단계에서 배아의 품질 평가 대 한 유용한 도구 수 있습니다. 그러나,이 실험 방법으로 전체 용어 개발에 효과 있다 하지 조사 되었습니다. 최근, FRAP를 사용 하 여 zygotic chromatin 풀림을 평가 하는 실험 시스템 개발 되었다. 왜냐하면이 zygotes 위한 새로운 관측 시스템, 그것 zygotic FRAP (zFRAP) 되 나 했다. zFRAP 전체 용어 개발을 비판적으로 미치지 않았다 고 되었습니다 보고 다른 곳에서7. 이 보고서에서이 실험 방법의 프로토콜을 설명 합니다.

Protocol

이 연구는 관심과 야마나시 대학의 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에서 권장 사항을 따라에서 수행 되었다. 프로토콜 야마나시 대학의 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 (허가 번호: A24-50). 모든 수술 tribromoethanol 마 취하에 수행 했다 하 고 고통을 최소화 하기 위해 모든 노력 했다. 절차 및 타임 테이블의 그림된 개요는 각각 그림 1 및 표 1에 표시 됩?…

Representative Results

eGFP H2B zFRAP 분석 제대로 생산 mRNA eGFP-H2B, 미행 (그림 2A) 폴 리로 인 한 이동된 밴드 볼, 인코딩 수정 (그림 2B) 후 1-3 h 2 극 시체 zygotes의 세포질으로 주입 했다. 8 12 수정 후 h, 2 pronuclei eGFP H2B의 식을 보여주는 함께 zygotes 수집 하 고 zFRAP 분석 (그림 2C)를 받게 했다. ?…

Discussion

이 연구에서 밝혀, zFRAP 분석 전체 용어 개발,이 방법은 분자 이벤트와 배아 발달 잠재력 사이 협회를 공개 하는 매우 유용한 도구 제안에 중요 한 손상을 발생 하지 않습니다. 그 세포의 차동 잠재력 된다 2 셀 단계 배아의 높은 ES 세포의 상태 처럼 2 셀으로 프로그래밍 하는 동안 chromatin 설사 변경으로 2 세포 단계 태아5와 비교 합니다. 따라서, zygotic chromatin 설사 배아 발달 잠재력…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리 감사 사토시 Kishigami, 사야카 와카야마, 히로 아키 Nagatomo, 사토시의 카 미 무라, 그리고가 나 Kishida 중요 한 의견 및 기술 지원 제공. 이 작품의 지;에 국립 대학 개혁을 승진 시키기를 위한 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 프로그램에 의해 부분적으로 투자 되었다 과학 (16 H 02593)의 승진, 아사 다 과학 재단과 T.W. 다케다 과학 재단에 대 한 일본 사회 Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다.

Materials

Confocal laser scaning microscope Olympus FV1200 FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)
Thermo plate Tokai Hit TP-110RH26
Inverted microscope Olympus IX71
Micro manupilator Narishige MMO-202ND
Pieze Micro Micromanipulator Prime tech PMAS-CT150
35 mm culture dish Falcom 351008 35 x 100 mm style; for IVF
60 mm culture dish Falcom 351007 60 x 15 mm style; for embryo culture
50 mm culture dish Falcom 351006 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage
50 mm glass bottom dish Matsunami D910400 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis
Mineral oil Organic spceiality chemicals 625071 For FRAP analysis on the glass bottom dishes
Mineral oil Sigma M8410-1L For IVF and embryo culture
glass capillary Drummond 1-000-1000 For handling mouse zygotes
Borosilicate glass Prime tech B100-75-10-PT For microinjection of mRNA
Micropipett puller Sutter instrument P-97/IVF For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) 
Microforge  Narishige MF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit Thermo
Fisher scientific
AM1340
Poly (A) tailing kit Thermo
Fisher scientific
AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF) IrvineSceientific 99311 HEPES buffered HTF containing 10% PVP
Sodium HEPES Sigma H3784
pTOPO eGFP-H2B Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye  Thermo
Fisher scientific
AM8551 For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA
Phenol chloroform isamyl alcohol nacalai tesque 25970-14
Chloroform nacalai tesque  08401-65
Not I TOYOBO NOT-111X
Ethachinmate WAKO 318-01793
3664 Otical power meter Hioki 3664  Power meter for laser power
Stereomicmicroscope Olympus SZX16

References

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Cite This Article
Ooga, M., Funaya, S., Aoki, F., Wakayama, T. Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development. J. Vis. Exp. (136), e57068, doi:10.3791/57068 (2018).

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