Fluorescenza zygotic recupero dopo lo sbiancamento foto analisi per scioltezza di cromatina che permette lo sviluppo di Full-term
Summary
Scioltezza di cromatina sembra essere coinvolto nel potenziale inerente allo sviluppo dei blastomeri. Tuttavia, non è noto se scioltezza della cromatina può essere utilizzato come un indice affidabile per il potenziale di sviluppo per gli embrioni. Qui, è stato descritto un sistema sperimentale in cui zigoti scioltezza-valutata della cromatina possono sviluppare al termine completo.
Abstract
La formazione immagine dal vivo è un potente strumento che permette l’analisi di eventi molecolari durante l’ontogenesi. Recentemente, la scioltezza della cromatina o apertura ha dimostrato di essere coinvolti nel potenziale differenziazione cellulare delle cellule staminali embrionali pluripotenti. Precedentemente è stato segnalato che confrontato con cellule staminali embrionali, zigoti harbor una struttura della cromatina estremamente allentata, suggerendo la sua associazione con la loro totipotenza. Tuttavia, fino ad ora, è non stato affrontato sia la struttura della cromatina estremamente allentata/Apri, è importante per il potenziale dello sviluppo embrionale. Nello studio presente, per esaminare questa ipotesi, è stato sviluppato un sistema sperimentale in cui zigoti che sono stati analizzati tramite fluorescenza recupero dopo lo sbiancamento foto può sviluppare a termine senza alcun danno significativo. D’importanza, questo sistema sperimentale deve solo thermos-piastra di riscaldamento oltre a un microscopio a scansione confocale del laser. I risultati di questo studio suggeriscono che il recupero fluorescenza dopo lo sbiancamento foto analisi (FRAP) analisi può essere utilizzato per studiare se gli eventi molecolari nella cromatina zygotic sono importanti per lo sviluppo di full-term.
Introduction
Dopo la fecondazione, la struttura della cromatina è alterata in modo dinamico e struttura della cromatina zygotic è poi alla fine stabilito1,2. Durante questo periodo, nel paterni pronuclei, le proteine della cromatina dominante sono trasformata da protamina istone. La cromatina risultante è estremamente diversa da quella di spermatozoi e ovociti femminili in diversi punti (ad es., composizione variante dell’istone, modifica dell’istone). Così, formato della cromatina zygotic è pensata per essere importante per il successivo sviluppo embrionale. Tuttavia, nonostante gli sforzi per rivelare i dettagli della struttura della cromatina zygotic per lunghi periodi, non sono mai stati metodi per valutare la qualità degli zigoti o per predire il loro sviluppo di termine nella fase di un cella analizzando la loro struttura della cromatina stabilito.
Nello studio precedente, si è scoperto che zigoti hanno una struttura della cromatina estremamente allentata3. Attualmente, scioltezza della cromatina o apertura è creduta per essere un fattore importante per la differenziazione cellulare potenziale di cellule staminali embrionali (ES)4. Le cellule ES non esibiscono omogeneità nella natura, ma sono piuttosto eterogenee; nelle colonie di cellule ES, alcuni transitoriamente acquisire un maggiore potenziale di differenziazione paragonabile a blastomeri degli embrioni in fase due-cellula. Durante questa transizione in due-cellula come stato, scioltezza della cromatina in ES cellule si trasforma in che cosa è paragonabile con fase bicellulare embrioni5. Così, scioltezza di cromatina sembra essere importante per potenziale di differenziazione cellulare ed è possibile che ampiamente aperto della cromatina in zigoti è utile per la valutazione del potenziale inerente allo sviluppo zygotic.
La formazione immagine dal vivo è un potente strumento che permette l’analisi di eventi molecolari durante l’ontogenesi in quanto questo metodo permette lo sviluppo successivo e anche pieno-termine sviluppo6. Come uno dei metodi di formazione immagine diretta, FRAP analisi sono stato utilizzato per esaminare la scioltezza della cromatina in embrioni preimpianto ed ES cellule3,4,5. Se scioltezza zygotic cromatina possa essere analizzato senza un effetto negativo sullo sviluppo di pieno-termine di FRAP analisi, può essere un valido strumento per la valutazione della qualità degli embrioni nella fase uno-cella. Tuttavia, non sono stati esaminati gli effetti sullo sviluppo di pieno-termine da questo metodo sperimentale. Recentemente, è stato sviluppato un sistema sperimentale utilizzando FRAP per valutare la scioltezza della cromatina zygotic. Perché questo era un nuovo sistema di osservazione per zigoti, esso è stato chiamato come zygotic FRAP (zFRAP). zFRAP non ha colpito criticamente termine sviluppo è stato segnalato altrove7. In questo rapporto, il protocollo di questo metodo sperimentale è descritto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Come rivelato in questo studio, l’analisi di zFRAP non causa danni critici al termine sviluppo, suggerendo che questo metodo è uno strumento molto utile per rivelare l’associazione tra eventi molecolari e il potenziale dello sviluppo embrionale. Durante la riprogrammazione, in due-cellula come stato di cellule ES, da cui il potenziale differenziale di quelle cellule diventa alto quanto quello di embrioni in fase bicellulare, scioltezza di cromatina cambia in quello paragonabile con fase bicellulare embrioni<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura e Kana Kishida per fornire supporto tecnico e commenti critici. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia programma per promuovere la riforma delle università nazionali al modus operandi; la società giapponese per la promozione della scienza (16h 02593), Asada Science Foundation e la Fondazione di scienza di Takeda a T.W. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.
Materials
| Confocal laser scaning microscope | Olympus | FV1200 | FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7) |
| Thermo plate | Tokai Hit | TP-110RH26 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Micro manupilator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pieze Micro Micromanipulator | Prime tech | PMAS-CT150 | |
| 35 mm culture dish | Falcom | 351008 | 35 x 100 mm style; for IVF |
| 60 mm culture dish | Falcom | 351007 | 60 x 15 mm style; for embryo culture |
| 50 mm culture dish | Falcom | 351006 | 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage |
| 50 mm glass bottom dish | Matsunami | D910400 | 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis |
| Mineral oil | Organic spceiality chemicals | 625071 | For FRAP analysis on the glass bottom dishes |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | For IVF and embryo culture |
| glass capillary | Drummond | 1-000-1000 | For handling mouse zygotes |
| Borosilicate glass | Prime tech | B100-75-10-PT | For microinjection of mRNA |
| Micropipett puller | Sutter instrument | P-97/IVF | For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit | Thermo Fisher scientific |
AM1340 | |
| Poly (A) tailing kit | Thermo Fisher scientific |
AM1350 | |
| PVP solution 10% (PVP-HTF) | IrvineSceientific | 99311 | HEPES buffered HTF containing 10% PVP |
| Sodium HEPES | Sigma | H3784 | |
| pTOPO eGFP-H2B | Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6) | ||
| NorthernMax Gly Sample loading Dye | Thermo Fisher scientific |
AM8551 | For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA |
| Phenol chloroform isamyl alcohol | nacalai tesque | 25970-14 | |
| Chloroform | nacalai tesque | 08401-65 | |
| Not I | TOYOBO | NOT-111X | |
| Ethachinmate | WAKO | 318-01793 | |
| 3664 Otical power meter | Hioki | 3664 | Power meter for laser power |
| Stereomicmicroscope | Olympus | SZX16 |
References
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