زيجوتيك Fluorescence الانتعاش بعد تبييض الصورة تحليل للارتخاء الكروماتين يتيح التنمية الكاملة ومدتها
Summary
يظهر الارتخاء الكروماتين أن تشارك في الإمكانات الإنمائية بلاستوميريس. ومع ذلك، لم يتضح ما إذا كان الارتخاء الكروماتين يمكن استخدامها كمؤشر موثوق لإمكانات النمو للأجنة. هنا، قد وصف نظام تجريبي التي يمكن أن تتطور الكروماتين zygotes تقييم الارتخاء لفترة كاملة.
Abstract
تصوير الحية هو أداة قوية تسمح لتحليل الأحداث الجزيئية خلال الخيطي. مؤخرا، ثبت أن تشارك في إمكانيات التمايز الخلوي للخلايا الجذعية الجنينية pluripotent الكروماتين الارتخاء أو الانفتاح. وذكر سابقا أن مقارنة مع الخلايا الجذعية الجنينية، ميناء zygotes بنية الكروماتين خففت جداً، مما يوحي بارتباطها بما توتيبوتينسي. ومع ذلك، حتى الآن، قد لم تعالج عما إذا كان هذا الهيكل الكروماتين الغاية خففت/فتح مهم لإمكانات النمو الجنينية. في هذه الدراسة، ولدراسة هذه الفرضية، وضع نظام تجريبي في زيجوتيس التي التي تم تحليلها بواسطة الأسفار الانتعاش بعد تبييض الصورة يمكن أن تتطور إلى المدة دون أي أضرار كبيرة. الأهم من ذلك، يحتاج هذا النظام التجريبي فقط سخان الترمس-لوحة بالإضافة إلى المسح مجهر ليزر [كنفوكل]. نتائج هذه الدراسة تشير إلى أن الانتعاش الأسفار بعد تبييض الصورة تحليل التحليل (فراب) يمكن استخدامها للتحقيق في ما إذا كانت الأحداث الجزيئية في الكروماتين زيجوتيك هامان للتنمية الكاملة ومدتها.
Introduction
بعد الإخصاب، هو تغيير بنية الكروماتين بشكل حيوي، وهيكل الكروماتين زيجوتيك ثم أنشئت في نهاية المطاف1،2. خلال هذه الفترة، والأب برونوكلي، يتم تغيير البروتين الكروماتين المهيمنة من البروتامين إلى هيستون. الكروماتين الناتجة من مختلف للغاية من الحيوانات المنوية وبويضات الإناث في عدة نقاط (مثلاً، التكوين البديل هستون، هستون تعديل). وهكذا، يعتقد الكروماتين زيجوتيك شكلت مهمة للتنمية الجنينية اللاحقة. ومع ذلك، وعلى الرغم من الجهود المبذولة للكشف عن تفاصيل هيكل الكروماتين زيجوتيك على مدى فترات طويلة، أساليب لتقييم نوعية زيجوتيس أو للتنبؤ بتنميتها الأجل الكامل في مرحلة واحدة-خلية عن طريق تحليل بنيتها الكروماتين لم تكن المنشأة.
في الدراسة السابقة، فهو اكتشف أن zygotes هيكل الكروماتين خففت الغاية3. في الوقت الراهن، يعتقد أن يكون عاملاً هاما في التمايز الخلوي المحتملة في الخلايا الجذعية الجنينية (ES)4الارتخاء الكروماتين أو الانفتاح. دإط الخلايا لا يحمل التجانس في الطبيعة، ولكن بدلاً من ذلك غير المتجانسة؛ في مستعمرات الخلايا دإط، اكتساب بعض عابر إمكانية تفريق أعلى يماثل blastomeres المرحلة اثنين خلايا الأجنة. خلال هذه المرحلة الانتقالية إلى الاثنين-الخلية مثل الدولة، خلايا الكروماتين الارتخاء في وفاق التغييرات إلى ما قابل للمقارنة مع المرحلة اثنين خلايا الأجنة5. وهكذا، يبدو الارتخاء الكروماتين لتكون هامة لإمكانيات التمايز الخلوي وأنه من الممكن أن فتح الكروماتين على نطاق واسع في زيجوتيس مفيد لتقييم الإمكانات الإنمائية زيجوتيك.
تصوير الحية هو أداة قوية تسمح لتحليل الأحداث الجزيئية خلال الخيطي حيث يسمح هذا الأسلوب لذلك من تنمية وتطوير كامل المدة حتى6. وقد استخدمت تحليل فراب كأحد أساليب التصوير الحي، دراسة الارتخاء الكروماتين في الأجنة preimplantation وداط الخلايا3،،من45. إذا كان يمكن تحليل الارتخاء الكروماتين زيجوتيك دون أثر ضار على التنمية الكاملة ومدتها بتحليل فراب، قد يكون أداة قيمة لتقييم نوعية الأجنة في مرحلة واحدة-الخلية. ومع ذلك، قد لا درست آثار على التنمية على المدى الكامل بهذا الأسلوب التجريبي. مؤخرا، تم تطوير نظام تجريبي لاستخدام فراب لتقييم الارتخاء الكروماتين زيجوتيك. لأن هذا نظام جديد لمراقبة زيجوتيس، وقد وصفته فراب زيجوتيك (زفراب). زفراب لم تؤثر على التنمية على المدى الكامل خطيرة، وقد ذكرت في مكان آخر7. ويرد في هذا التقرير، البروتوكول هذا الأسلوب التجريبي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحليل زفراب كما اتضح في هذه الدراسة، لا يسبب الضرر الحرجة للتنمية على المدى الكامل، مما يوحي بهذا الأسلوب أداة مفيدة للغاية للكشف عن الرابطة بين الأحداث الجزيئية وإمكانية إنمائية الجنينية. أثناء إعادة برمجة، إلى الاثنين-الخلية مثل الدولة دإط الخلايا، ومن خلالها إمكانيات تفضيلية لتلك ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر ساتوشي كيشيجامي، واكاياما ساياكا، هيرواكي ناغاتومو، كاميمورا ساتوشي، وكانا كيشيدا لتوفير الدعم التقني والتعليقات الانتقادية. تم تمويل هذا العمل جزئيا بالبرنامج وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا لتعزيز الإصلاح للجامعات الوطنية إلى مو؛ الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (16 ح 02593) ومؤسسة العلوم اسادا ومؤسسة العلوم وتاكيدا ل T.W. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة.
Materials
| Confocal laser scaning microscope | Olympus | FV1200 | FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7) |
| Thermo plate | Tokai Hit | TP-110RH26 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Micro manupilator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pieze Micro Micromanipulator | Prime tech | PMAS-CT150 | |
| 35 mm culture dish | Falcom | 351008 | 35 x 100 mm style; for IVF |
| 60 mm culture dish | Falcom | 351007 | 60 x 15 mm style; for embryo culture |
| 50 mm culture dish | Falcom | 351006 | 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage |
| 50 mm glass bottom dish | Matsunami | D910400 | 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis |
| Mineral oil | Organic spceiality chemicals | 625071 | For FRAP analysis on the glass bottom dishes |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | For IVF and embryo culture |
| glass capillary | Drummond | 1-000-1000 | For handling mouse zygotes |
| Borosilicate glass | Prime tech | B100-75-10-PT | For microinjection of mRNA |
| Micropipett puller | Sutter instrument | P-97/IVF | For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit | Thermo Fisher scientific |
AM1340 | |
| Poly (A) tailing kit | Thermo Fisher scientific |
AM1350 | |
| PVP solution 10% (PVP-HTF) | IrvineSceientific | 99311 | HEPES buffered HTF containing 10% PVP |
| Sodium HEPES | Sigma | H3784 | |
| pTOPO eGFP-H2B | Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6) | ||
| NorthernMax Gly Sample loading Dye | Thermo Fisher scientific |
AM8551 | For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA |
| Phenol chloroform isamyl alcohol | nacalai tesque | 25970-14 | |
| Chloroform | nacalai tesque | 08401-65 | |
| Not I | TOYOBO | NOT-111X | |
| Ethachinmate | WAKO | 318-01793 | |
| 3664 Otical power meter | Hioki | 3664 | Power meter for laser power |
| Stereomicmicroscope | Olympus | SZX16 |
References
- Burton, A., Torres-Padilla, M. E. Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo. Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).
- Okada, Y., Yamaguchi, K. Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond. Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).
- Ooga, M., Fulka, H., Hashimoto, S., Suzuki, M. G., Aoki, F. Analysis of chromatin structure in mouse preimplantation embryos by fluorescent recovery after photobleaching. Epigenetics. 11, 85-94 (2016).
- Meshorer, E., et al. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
- Boskovic, A., et al. Higher chromatin mobility supports totipotency and precedes pluripotency in vivo. Genes Dev. 28, 1042-1047 (2014).
- Yamagata, K., Ueda, J. Long-term live-cell imaging of mammalian preimplantation development and derivation process of pluripotent stem cells from the embryos. Dev Growth Differ. 55, 378-389 (2013).
- Ooga, M., Wakayama, T. FRAP analysis of chromatin looseness in mouse zygotes that allows full-term development. PLoS One. 12, e0178255 (2017).
- Quinn, P., Begley, A. Effect of human seminal plasma and mouse accessory gland extracts on mouse fertilization in vitro. Australian journal of biological sciences. 37, 147-152 (1984).
- Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biology of reproduction. 42, 432-440 (1990).
- Bae, J., Sung, B. H., Cho, I. H., Song, W. K. F-actin-dependent regulation of NESH dynamics in rat hippocampal neurons. PLoS One. 7, e34514 (2012).
- Dieteren, C. E., et al. Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits. Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).
- Subramanian, V., et al. H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation. PLoS Genet. 9, e1003725 (2013).
- Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).
- Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging. Dev Biol. 304, 409-419 (2007).
- Puschendorf, M., et al. PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos. Nat Genet. 40, 411-420 (2008).
