İki fotonlu lazer mikroskop kullanarak hücre zarı tamir tahlil
Summary
Hücre zarının iki fotonlu lazer ile yaralama membran yeniden mühürlemeden yeteneği değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir ve birden çok hücre türü için uygulanabilir. Burada, vitro canlı İki fotonlu lazer ablasyon takip dysferlinopathy hasta hücrelerde membran yeniden mühürleme, görüntüleme için bir protokol açıklayın.
Abstract
Çok sayıda patofizyolojik hakaret hücre zarlarında zarar verebilir ve hücre zarının onarım veya bütünlüğü, doğuştan gelen kusurlar ile birleştiğinde hastalığı neden olabilir. Hücre zarı tamir çevreleyen temel moleküler mekanizmaları anlama, bu nedenle, işlevsel olmayan hücre zarı dynamics ile ilişkili hastalıklar için yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için önemli bir amacın var. Hücre zarının çeşitli hastalık bağlamlarda yeniden mühürlemeden anlama amaçlayan birçok içinde in vitro ve in vivo çalışmada İki fotonlu lazer ablasyon fonksiyonel sonuçlar deneysel tedavileri takip belirlemek için standart olarak kullanmaktadır. Bu tahlil, hücre zarlarında hücre membran rüptürü ve hücre sızmaya floresan boya için neden bir iki fotonlu lazer ile yaralama için tabi tutulmaktadır. Hücre içinde floresan yoğunluğu sonra kendisini yeniden mühürlemek için hücrenin yeteneği ölçmek için takip edilebilir. Hücre zarının yanıt yaralanma, yaklaşım kendini yaralama İki fotonlu lazer büyük varyasyon olarak değerlendirmek için birkaç farklı yöntemi var, bu nedenle, hücre yaralama bir tek, birleştirilmiş model beneficially azaltmak için hizmet verecek Bu metodolojileri arasında varyasyon. Bu makalede, basit bir iki fotonlu lazer hücre zarı tamir vitro hem de sağlıklı ve dysferlinopathy hastanın fibroblast hücreleri veya bir tam uzunlukta dysferlin plazmid olmadan transfected değerlendirilmesi için protokol yaralama anahat.
Introduction
Bir çift-hücre içi/hücre dışı ortam tanımlar ve hücresel homeostazı ve hücre yaşam bakımı için önemlidir tabaka-in protein çivili fosfolipitler, ökaryotik hücre hücre zarı oluşur. Hücre zarının yaralanmaları mekanik veya kimyasal hakaret kaynaklanan çeşitli memeli hücre türleri sıradan, dahil iskelet ve kalp kası, mide ve akciğer hücreleri1,2,3,4. Yaralanmalar için günlük fizyolojik fonksiyon sonucu ek olarak, hücre zarlarında Ayrıca çevre hakaret, bakteriyel toksinler ve iskemik reperfüzyon5tarafından zarar görebilir. Hücre membran yırtığı yeniden mühürlemek için başarısızlık ekstraselüler Ca2 +– diğer potansiyel olarak toksik ekstraselüler bileşenleri – ile birlikte bir düzensiz akını hücre içine hızlı bir şekilde hücre neden olabilir aşağı akım sinyal cascades tetikleme yol açar Ölüm1,4,5,6.
Bugüne kadar hücrelerde membran onarım için birkaç önerilen modelleri olmuştur. Farklı onarım mekanizmaları boyutuna ve membran rüptürü niteliğine bağlı olarak etkinleştirilebilir. Örneğin, bu hücre zarlarında yanal akışı veya küçük aksamalar onarmak için tıkanma protein yararlanmak olabilir önerilmektedir (< 1 nm). Membran yırtığı hızla yanal alımı dysferlin içeren tamir lateral füzyon modeli öneriyor küçük delikler protein toplamalardan tamir modeli tıkanma protein öneriyor iken membran7, (çoğunlukla annexins) 8. diğer taraftan, daha büyük membran lezyonlar Ca2 +tetik-bağımlı, dysferlin-aracılı vezikül fusion ve onarım yama oluşumu. Onarım yama modelinde, hücre içine hızlı bir Ca2 + akın bir kompleks veya “yama”, bir füzyon ile birlikte hücre içi veziküller formu birden fazla protein (dysferlin, annexins, mitsugumin-53 ve EDH proteinler) alımı tetikler veya organellerin membran sitesinde4,9,10,11,12zarar. Bu modeller mutlaka birbirini dışlamaz ve membran onarım kolaylaştırmak için konserde işe yaramayabilir unutmamak gerekir. Düzgün hücre zarının hasar yeniden mühürlemek için başarısızlık Muskuler Distrofi (dysferlinopathy – Miyoshi myopathy, bacak-korse Muskuler Distrofi Tip IIb ve anterior tibial başlangıçlı ile distal myopathy gibi) da dahil olmak üzere birden çok hastalık durumlarında ile ilişkilidir 13, kardiyomiyopati14ve Chediak-Higashi Sendromu (CHS)15.
O uygun hücre zarının bütünlüğü ve oyun yeniden mühürlemeden verilen Sağlık ve hastalığında, önemli bir rol hücre zarı tamir temel moleküler mekanizmaları daha derin bir anlayış roman tedavi stratejileri için arama yararlı olacaktır. Bu, bu nedenle, Kinetik izlemek ve hücre zarının Onarım yeteneğini değerlendirmek için uygun deneysel teknikleri sahip olmak gereklidir. Birkaç vitro yöntemi membran onarım modelleme için tasarlanmıştır. Bir strateji bir pipet/cerrahi bıçaklı/tıraş bıçağı ile veya cam boncuk hücreleri16üzerinde çalışırken tarafından hücre kazıma kolaylaştırılabilir mekanik yaralanma içerir. Ancak, bu tür mekanik yaralanma daha büyük lezyonlar oluşturur ve hücre yaralanmalarında, içinde ve kültürler arası değişim yüksek derecede oluşturur.
Membran yaralar üreten başka bir lazer ablasyon İki fotonlu mikroskobu tarafından yöntemdir. Tek foton uyarma kullanan geleneksel lazer confocal mikroskobu aksine, İki fotonlu lazer aynı anda bir yüksek enerjili elektron17uyarma kolaylaştırmak için iki uzun dalga boyu, düşük enerjili fotonlar kullanır. Uyarma sadece odak düzlemi içinde ve tüm ışık yolunu17 (şekil 1) boyunca doğrusal olmayan bu işlem sonuçlanır. Bu uyarma birim yardımcı olur duyarlilik canlı hücreleri18,19görüntüleme en alt düzeyde tutmak için azaltılmış. Araştırmacılar bu nedenle hücre zarı ve monitör membran gerçek zamanlı olarak floresan boyalar kullanarak ve floresan yoğunluğu hücre membran yırtığı ve reseals olarak değişiklikler gözlemleyerek yeniden mühürlemeden kesin lezyonlar elde edebilecektir.
Bu yaklaşımı art arda içinde in vitro ve in vivo yaralama membran eğitim için kullanılan ve birden çok hücreye20,21türleri. Örneğin, membran fibroblastlar ve hastaların bu tekniği22,23kullanarak değerlendirildi dysferlinopathy türetilen myotubes hatalarını onarın. Ayrıca, tek kas lifleri fareler izole onarım yama oluşumu13,24,25izlemek için kullanılmıştır. Hareket fluorescently tagged proteinlerin tek kas lifleri9membran onarım sırasında da görülebilir. Ayrıca, Zebra balığı embriyo İki fotonlu lazer yaralama takip sarcolemmal onarım süreci içinde gerçek-zaman içinde vivo26görülebilmektedir.
Bu makalede, biz her ne kadar bu metodoloji plazma zarı yeteneği yeniden mühürlemeden miktarının amacıyla çeşitli hücre tiplerinin uygulanabilir hücre zarı tamir dinamiklerini kullanarak iki fotonlu lazer yaralama, fibroblastlar değerlendirmek için bir metodoloji anahat vitro. Bu yöntemde, hücreleri FM4-64 ile inkübe, olumsuz bağlanır gibi hızlı bir şekilde fluoresces lipofilik, hücre geçirimsiz boya fosfolipitler sitoplazma hücre membran lezyon üzerinden girdikten sonra içinde tahsil (Şekil 2& 3). boya Floresans membran lezyon komşu miktar sağlar kendisini yeniden mühürlemek hücre zarı için geçen süre izlemek için. Bu yöntemin yarar örneklemek için biz tam uzunlukta dysferlin (DYSF) GFP Birleşik Plasmid’ler ile transfected dysferlinopathy hastanın fibroblast hücre zarı tamir kurtarma değerlendirmek için kullanın.
Protocol
Representative Results
Discussion
İki fotonlu lazer hücre membran yaralama içinde vitroyeniden mühürlemeden membran dinamikleri değerlendirmek için hassas ve çok yönlü bir tekniktir. Bu makalede, hücre zarının dysferlinopathy hasta hücrelerin tahlil yaralama İki fotonlu lazer kullanarak yeteneği yeniden mühürlemeden belirlemek için bir iletişim kuralı açıklanan. Dysferlinopathy hasta hücrelerin hücre zarının yeniden mühürleme, arızalı diğer araştırmacılar tarafından bulguları ile uyumlu olduğu ve hangi daha …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser yenilik (CFI) tıp ve diş hekimliği, arkadaş, Garrett Cumming araştırma sandalye Fonu, HM Toupin nörolojik bilim araştırma sandalye Fonu, kas distrofisi Kanada, Kanada Vakfı Alberta Üniversitesi Fakültesi tarafından desteklenmiştir, Alberta ileri eğitim ve Teknoloji (AET), Kanadalı Sağlık Araştırma (CIHR), Jesse’nin yolculuk – gen ve hücre tedavisi, kadın ve çocuk sağlığı Araştırma Enstitüsü (WCHRI), temeli enstitüleri ve Alberta Sağlık Çözümleri (AIHS yeniliklerin ).
Dr. Steven Laval tam uzunlukta dysferlin plazmid ile bize sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Dr Katsuya Miyake teknik tavsiye için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 35mm collagen-coated glass-bottom dishes | MatTek | P53GCOL-1.5-14-C | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| FM 4-64 Dye | Invitrogen | T13320 | |
| Tyrode’s Salts Solution | Sigma-Aldrich | T2397 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | NA | |
| Chameleon Two-photon laser | Coherent | NA |
References
- Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).
- Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).
- McNeil, P. L., Ito, S. Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo. Gastroenterology. 96 (5 Pt 1), 1238-1248 (1989).
- McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 499-505 (2005).
- Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiol Rev. 95 (4), 1205-1240 (2015).
- Geeraerts, M. D., Ronveaux-Dupal, M. F., Lemasters, J. J., Herman, B. Cytosolic free Ca2+ and proteolysis in lethal oxidative injury in endothelial cells. Am J Physiol. 261 (5 Pt 1), C889-C896 (1991).
- McDade, J. R., Archambeau, A., Michele, D. E. Rapid actin-cytoskeleton-dependent recruitment of plasma membrane-derived dysferlin at wounds is critical for muscle membrane repair. FASEB J. 28 (8), 3660-3670 (2014).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4 (Unit 4), 11-24 (2013).
- Demonbreun, A. R., et al. An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle. J Cell Biol. 213 (6), 705-718 (2016).
- McNeil, P. L., Khakee, R. Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage. Am J Pathol. 140 (5), 1097-1109 (1992).
- Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. J Cell Biol. 137 (1), 93-104 (1997).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106 (2), 157-169 (2001).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423 (6936), 168-172 (2003).
- Han, R., et al. Dysferlin-mediated membrane repair protects the heart from stress-induced left ventricular injury. J Clin Invest. 117 (7), 1805-1813 (2007).
- Huynh, C., Roth, D., Ward, D. M., Kaplan, J., Andrews, N. W. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (48), 16795-16800 (2004).
- Corrotte, M., Castro-Gomes, T., Koushik, A. B., Andrews, N. W. Approaches for plasma membrane wounding and assessment of lysosome-mediated repair responses. Methods Cell Biol. 126, 139-158 (2015).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Jontes, J. D., Buchanan, J., Smith, J. S. Growth cone and dendrite dynamics in zebrafish embryos: early events in synaptogenesis imaged in vivo. Nat Neurosci. 3 (3), 231-237 (2000).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4592-4597 (2003).
- Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. J Vis Exp. (52), (2011).
- Matsuda, C., Kiyosue, K., Nishino, I., Goto, Y., Hayashi, Y. K. Dysferlinopathy Fibroblasts Are Defective in Plasma Membrane Repair. PLoS Curr. 7, (2015).
- Philippi, S., et al. Dysferlin-deficient immortalized human myoblasts and myotubes as a useful tool to study dysferlinopathy. PLoS Curr. 4, RRN1298 (2012).
- Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11 (1), 56-64 (2009).
- Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (16), 6004-6009 (2014).
- Roostalu, U., Strahle, U. In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma. Dev Cell. 22 (3), 515-529 (2012).
- Azakir, B. A., et al. Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules. J Biol Chem. 287 (33), 27629-27636 (2012).
- Lee, J., Yokota, T., Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. Ch 6. Translational Research in Muscular Dystrophy. , 87-102 (2016).
- Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies. Mol Med. 17 (9-10), 875-882 (2011).
