Essai de réparation Membrane cellulaire à l’aide d’un Microscope biphotonique Laser

La membrane cellulaire des cellules eucaryotes est constitué d’une double couche de phospholipides parsemées de protéine qui définit l’environnement intra/extracellulaire de la cellule et est essentielle pour maintenir la survie cellulaire de l’homéostasie et de la cellule. Membrane cellulaire blessures dus aux insultes mécaniques ou chimiques sont monnaie courante dans les divers types de cellules de mammifères, y compris squelettique et muscle cardiaque, estomac et poumon cellules^1,2,3,4. En plus des blessures consécutives à une fonction physiologique quotidienne, membranes cellulaires peuvent également être endommagés par insultes environnementales, des toxines bactériennes et ischémie reperfusion⁵. Défaut de refermer les ruptures dans la membrane cellulaire conduit à un afflux non réglementé d’extracellulaire Ca^{2 +}– ainsi que d’autres composants extracellulaires potentiellement toxiques – dans la cellule, cascades de signal en aval qui peuvent se traduire rapidement par cellule de déclenchement mort^1,4,5,6.

A ce jour, il y a eu plusieurs modèles proposés pour la réparation de membrane de cellules. Les mécanismes de réparation différents peuvent être activés selon la taille et la nature de la rupture des membranes. Par exemple, il est suggéré que les membranes cellulaires peut utiliser écoulement latéral ou protéine colmatage pour réparer les petites perturbations (< 1 nm). Le modèle de fusion latérale propose que les ruptures de la membrane sont rapidement mandés par le biais de recrutement latéral dysferline contenant de la membrane⁷, tandis que la protéine colmatage modèle suggère que les petites perforations sont mandées par agrégations de protéine (surtout ANNEXINES) ⁸. à l’inverse, déclenchent des lésions plus grandes de membrane Ca^{2 +}-la fusion des vésicules dépendants, dysferline médiation et formation d’un patch de réparation. Dans le modèle de patch de réparation, un influx de Ca^{2 +} rapid dans la cellule déclenche le recrutement de plusieurs protéines (dysferline, ANNEXINES, mitsugumin-53 et protéines EDH) qui forment un complexe ou la « tache », ainsi qu’une fusion des vésicules intracellulaires ou lysosomes sur le site de membrane endommagent^4,9,10,11,12. Il est important de noter que ces modèles ne sont pas nécessairement mutuellement exclusifs et peuvent travailler de concert afin de faciliter la réparation de la membrane. Défaut de resceller correctement les dommages de la membrane cellulaire est associée à plusieurs états pathologiques, y compris la dystrophie musculaire (dysferlinopathy – y compris la myopathie Miyoshi, ceintures dystrophie musculaire type IIB et myopathie distale avec apparition tibiale antérieure) ¹³,¹⁴de la cardiomyopathie et syndrome de Chediak-Higashi syndrome (CHS)¹⁵.

Compte tenu de cette intégrité de la membrane de la cellule appropriée et rescellage fois un rôle si important dans la santé et la maladie, une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents de la membrane cellulaire de réparation serait bénéfique à la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques. Il est, par conséquent, nécessaire de posséder des techniques expérimentales appropriées pour suivre la cinétique et d’évaluer la capacité de réparation de la membrane cellulaire. Plusieurs méthodes in vitro pour la modélisation de réparation de membrane ont été conçus. Une stratégie implique une lésion mécanique, qui peut être facilitée par la cellule gratter avec un lame pipette/chirurgie/rasoir ou en faisant rouler les billes de verre sur les cellules¹⁶. Toutefois, ce type de lésion mécanique génère des lésions plus grandes et crée un haut degré de variation dans les lésions des cellules, aussi bien au sein et entre les cultures.

Une autre méthode de génération des plaies de la membrane est ablation laser par microscopie biphotonique. Contrairement à la microscopie confocal laser traditionnel qui emploie l’excitation monophotonique, le deux photons laser utilise simultanément deux photons de longueur d’onde, faible consommation d’énergie pour faciliter l’excitation d’un électron à haute énergie¹⁷. Ce processus non linéaire aboutit à excitation exclusivement dans le plan focal et non pas suivant le trajet de la lumière toute¹⁷ (Figure 1). Cela réduit l’excitation volume contribue à réduire le photovieillissement lors de l’imagerie de cellules vivantes^18,19. Les chercheurs sont donc en mesure de générer des lésions précises dans la membrane cellulaire et moniteur membrane rescellage en temps réel en utilisant des colorants fluorescents et en observant les changements dans l’intensité de fluorescence, les ruptures de la membrane cellulaire, puis rescellages.

Cette approche a été utilisée à plusieurs reprises pour étudier la membrane blessant in vitro et in vivo et dans la cellule plusieurs types^20,21. Par exemple, membrane réparer les défauts de fibroblastes et de myotubes, dérivés de dysferlinopathy, les patients ont été évalués à l’aide de cette technique^22,23. Également, les fibres musculaires simples isolés de souris ont été utilisées pour contrôler réparation patch formation^13,24,25. La circulation des protéines fluorescent étiquetées peut également être observée lors de la réparation de la membrane en fibres musculaires simples⁹. En outre, le processus de réparation du sarcolemme, suite à deux photons laser blessant dans des embryons de poisson-zèbre s’observe en temps réel en vivo²⁶.

Dans cet article, nous décrivons une méthode d’évaluation dynamique de réparation de membrane cellulaire dans les fibroblastes en utilisant deux photons laser blessant, bien que cette méthodologie peut être appliquée à différents types de cellules dans le but de quantifier la membrane plasmique rescellage capacité in vitro. Dans cette méthode, les cellules sont incubées avec FM4-64, un colorant lipophile, cellule-imperméable qui rapidement produit une fluorescence tel qu’il se lie à négativement chargé des phospholipides dans le cytoplasme en entrant dans la cellule par l’intermédiaire de la lésion de la membrane (Figure 2& 3). quantification de la fluorescence de colorant adjacente à la lésion de la membrane permet de contrôler le temps qu’il faut pour la membrane de la cellule à se refermer. Pour illustrer l’utilité de cette méthode, nous utilisons dysferlinopathy patient fibroblastes transfectées avec les plasmides de conjugaison GFP pleine longueur dysferline (DYSF) pour évaluer le sauvetage de réparation de la membrane cellulaire.