Assay ремонт мембраны клеток с помощью двух Фотон лазерный микроскоп

Клеточной мембраны эукариотической клетки состоит из двухслойной белка шипованных фосфолипидов который определяет intra/внеклеточных среды ячейки и имеет важное значение для поддержания клеточного гомеостаза и ячейку выживания. Клеточной мембраны травм, связанных с механической или химической оскорбления являются обычным явлением в различных типах клеток млекопитающих, включая скелетных и сердечной мышцы, желудка и легких клетки^1,2,3,4. Помимо травмы в результате ежедневных физиологические функции клеточных мембран также могут быть повреждены экологической оскорбления, бактериальные токсины и ишемии-реперфузии⁵. Неспособность запечатать разрывов в клеточной мембраны ведет к нерегулируемый приток внеклеточного Ca^{2 +}– наряду с других потенциально токсичных компонентов внеклеточного – в клетку, вызывая течению сигнала каскады, которые могут быстро привести к ячейке смерти^1,4,5,6.

На сегодняшний день, были несколько предложенных моделей для ремонта мембраны в клетках. Ремонт различных механизмов могут активироваться в зависимости от размера и характера разрыва мембраны. Например, предполагается, что клеточные мембраны могут использовать боковое поток или белка, засорение для ремонта небольших сбоев (< 1 Нм). Модель бокового fusion предлагает, что мембрана разрывы быстро зашли через боковые набора dysferlin содержащих мембраны⁷, в то время как белок, засорение модель предполагает, что небольшие проколы рекомендованный через агрегаты белка (в основном Аннексины) ⁸. и наоборот, более крупные поражения мембраны триггер Ca^{2 +}-зависимых, dysferlin опосредованной везикул фьюжн и формирование патч ремонт. В модели патч ремонт, быстрый Ca^{2 +} приток в ячейку запускает набор нескольких белков (dysferlin, аннексины, mitsugumin-53 и EDH белки), которые образуют комплекс или «патч», наряду с сочетанием внутриклеточных везикулы или на сайте мембраны лизосом ущерб^4,9,10,,1112. Важно отметить, что эти модели не обязательно являются взаимоисключающими и могут работать в концерте для облегчения ремонта мембраны. Неспособность должным образом запечатать повреждение клеточной мембраны связан с несколькими государствами болезни, включая мышечная дистрофия (dysferlinopathy – включая Миеси миопатии и конечности ремень мышечная дистрофия типа IIB дистальная миопатия с передней большеберцовой начала) ¹³,¹⁴кардиомиопатия и Чедиака-Хигаси синдром (CHS)¹⁵.

Учитывая, что целостность надлежащего клеточной мембраны и запечатывания играет такую важную роль в здоровье и болезни, более глубокое понимание глубинные механизмы клеточной мембраны ремонта бы полезно в поисках роман терапевтических стратегий. Это, таким образом, необходимо иметь соответствующие экспериментальные методы для мониторинга кинетики и оценить способность клеточной мембраны ремонта. Были разработаны несколько в vitro методы для моделирования мембраны ремонт. Одна стратегия включает механические травмы, которая может способствовать клеток соскоб с пипеткой/хирургическое лезвие/бритвой или путем опрокидывания клетки¹⁶стеклянные бусины. Однако этот тип механических повреждений генерирует большие поражения и создает высокую степень изменчивости в ячейке травмы, как внутри, так и между культурами.

Другой способ генерации мембраны раны является лазерной абляции, два Фотон микроскопии. В отличие от традиционного лазера confocal микроскопии, которая использует один фотон возбуждения два фотона лазерного одновременно использует две длинные волны, низкой энергии фотонов для облегчения возбуждения электронов¹⁷. Этот нелинейный процесс приводит возбуждения исключительно в пределах фокальной плоскости и не вдоль всего пути света¹⁷ (рис. 1). Это сократило объем помогает возбуждение к минимуму фотоповреждения при визуализации живых клеток^18,19. Поэтому исследователи способны генерировать точного поражения в клеточной мембраны и монитор мембраны запечатывания в режиме реального времени с помощью флуоресцентных красителей и наблюдения изменений в интенсивности флуоресценции клеточной мембраны разрывы, а затем reseals.

Этот подход неоднократно использовались для изучения мембраны, ранив в пробирке и в естественных условиях и в несколько ячеек типы^20,21. Например мембран ремонта дефектов фибробластов и myotubes, производный от dysferlinopathy, которую больных оценивали с помощью этой техники^22,23. Кроме того один мышечных волокон, изолированные от мышей были использованы для мониторинга ремонт патч формирования^13,24,25. Движение дневно тегами белков может также наблюдаться во время ремонта мембраны в одном мышечных волокон⁹. Кроме того процесс sarcolemmal восстановления после двух фотона лазерного ранения в zebrafish эмбриона можно наблюдать в режиме реального времени в vivo²⁶.

В этой статье мы приводим методологию для оценки динамики ремонт клеточной мембраны в фибробласты, используя два фотона лазерного ранения, хотя эта методология может применяться для различных типов клеток с целью количественного определения плазматической мембраны запечатывания способность в пробирке. В этом методе, клетки инкубируют с FM4-64, липофильных, клетки непроницаемый краситель, который быстро флуоресцирует как он привязывается к отрицательно заряженных фосфолипидов в цитоплазме при входе в клетку через мембраны поражения (рис. 2& 3). Количественная оценка краситель флуоресценции рядом с поражением мембраны позволяет для наблюдения за время, которое требуется для клеточной мембраны для запечатывания сам. Чтобы проиллюстрировать полезность этого метода, мы используем dysferlinopathy пациента фибробластов transfected с плазмид GFP-конъюгированных полнометражные dysferlin (DYSF) для оценки спасательных ремонт клеточной мембраны.