Analisi di riparazione della membrana cellulare usando un microscopio a due fotoni Laser

La membrana cellulare delle cellule eucariotiche è costituito da un doppio strato di fosfolipidi tempestato di proteina che definisce l’ambiente intra/extracellulari della cella ed è essenziale per il mantenimento della sopravvivenza delle cellule e l’omeostasi cellulare. Membrana cellulare lesioni derivanti da insulti meccanici o chimici sono comuni in vari tipi di cellule di mammiferi, tra cui scheletrico e muscolo cardiaco, stomaco e polmone cellule^1,2,3,4. Oltre alle lesioni conseguenti alla funzione fisiologica quotidiana, le membrane cellulari può essere danneggiate anche da insulti ambientali, tossine batteriche e riperfusione ischemica⁵. Errore per sigillare le rotture nella membrana cellulare comporta un afflusso non regolamentato di extracellulare Ca^{2 +}– insieme ad altri componenti extracellulari potenzialmente tossici – nella cellula, innescando cascate di segnale a valle che possono rapidamente portare in cella ^5,1,4,di morte⁶.

Fin qui, ci sono stati diversi modelli proposti per la riparazione di membrana in cellule. Meccanismi di riparazione diversi possono essere attivati a seconda della dimensione e natura della rottura della membrana. Ad esempio, è suggerito che le membrane cellulari può utilizzare flusso laterale o proteina intasamento per riparare piccoli guasti (< 1 nm). Il modello di fusione laterale propone che rotture della membrana sono rapidamente riparate attraverso reclutamento laterale di dysferlin-contenente membrana⁷, mentre la proteina intasamento modello suggerisce che piccole perforazioni sono riparate attraverso aggregazioni di proteina (principalmente annexins) ⁸. al contrario, le più grandi lesioni della membrana innescano Ca^{2 +}-fusione della vescicola dipendente, dysferlin-mediata e la formazione di una patch di riparazione. Nel modello di patch di riparazione, un rapido afflusso Ca^{2 +} nella cella attiva il reclutamento di proteine multiple (disferlina, annexins, mitsugumin-53 e proteine EDH) che formano un complesso o “patch”, insieme a una fusione delle vescicole intracellulari o i lisosomi presso il sito della membrana danneggiano^4,9,10,11,12. È importante notare che questi modelli non sono necessariamente mutuamente esclusivi e possono lavorare di concerto per facilitare la riparazione della membrana. Fallimento per sigillare correttamente danno della membrana delle cellule è associato a più Stati di malattia, compreso la distrofia muscolare (disferlinopatia – tra cui Miyoshi myopathy e distrofia muscolare dei cingoli, tipo IIB e miopatia distale con esordio tibia anteriore) ¹³, cardiomiopatia¹⁴e Chediak-Higashi sindrome (CHS)¹⁵.

Data tale integrità della membrana cellulare corretta e risigillazione gioca un ruolo importante nella salute e nella malattia, una più profonda comprensione dei meccanismi molecolari sottostanti di riparazione della membrana cellulare sarebbe utile nella ricerca di nuove strategie terapeutiche. È, pertanto, necessario possedere adeguate tecniche sperimentali per la cinetica di monitorare e valutare la capacità di riparazione della membrana cellulare. Sono stati progettati diversi metodi in vitro per la modellazione di riparazione della membrana. Una strategia comporta danno meccanico, che può essere facilitata da cella raschiando con un pipetta/chirurgica/rasoio della lama o dal ribaltamento le cellule¹⁶perle di vetro. Tuttavia, questo tipo di danno meccanico genera più grandi lesioni e crea un alto grado di variazione nella lesione delle cellule, sia all’interno che tra le culture.

Un altro metodo per generare le ferite della membrana è l’ablazione laser da microscopia del due-fotone. In contrasto con la microscopia confocale laser tradizionale che si avvale di eccitazione di singolo fotone, il laser del due-fotone utilizza contemporaneamente due fotoni di lunghezza d’onda, basso consumo energetico per facilitare l’eccitazione di un elettrone ad alta energia¹⁷. Questo processo non lineare provoca eccitazione esclusivamente all’interno del piano focale e non lungo l’ intero percorso della luce¹⁷ (Figura 1). Questo ridotto volume di eccitazione consente di minimizzare photodamage quando imaging cellule vive^18,19. I ricercatori sono quindi in grado di generare lesioni precise nella membrana cellulare e monitor membrana una chiusura in tempo reale utilizzando coloranti fluorescenti e osservare i cambiamenti dell’intensità di fluorescenza come le rotture della membrana cellulare e quindi reseals.

Questo approccio è stato utilizzato ripetutamente per studiare membrana ferendo in vitro e in vivo e in cella più tipi di^20,21. Ad esempio, membrana riparare difetti nei fibroblasti e miotubi derivato da disferlinopatia pazienti sono stati valutati usando questa tecnica^22,23. Inoltre, singole fibre muscolari isolate da topi sono state utilizzate per monitorare la riparazione patch formazione^13,24,25. Il movimento delle proteine fluorescente contrassegnati può essere osservato anche durante la riparazione della membrana in singole fibre muscolari⁹. Inoltre, il processo di riparazione sarcolemma seguendo due fotoni laser ferendo negli embrioni di zebrafish può essere osservato in tempo reale in vivo²⁶.

In questo articolo, descriviamo una metodologia per la valutazione dinamica di riparazione della membrana cellulare in fibroblasti utilizzando due fotoni laser ferendo, anche se questa metodologia può essere applicata a vari tipi di cellule allo scopo di quantificare la membrana plasmatica chiusura della capacità in vitro. In questo metodo, le cellule vengono incubate con FM4-64, un colorante lipofilico, cella-impermeabile che reagisce rapidamente in quanto si lega al negativamente caricata fosfolipidi all’interno del citoplasma al momento di entrare nella cellula attraverso la lesione della membrana (Figura 2& 3). quantificazione della fluorescenza di tintura adiacente alla lesione della membrana permette di monitorare il tempo che occorre per la membrana cellulare sigillare stessa. Per esemplificare l’utilità di questo metodo, usiamo disferlinopatia transfettati con i plasmidi GFP-coniugato full-length dysferlin (DYSF) nei fibroblasti del paziente per valutare il salvataggio di riparazione della membrana cellulare.