Voorbereiding verse retinale segmenten van volwassen Zebrafish voor Ex Vivo Imaging experimenten
Summary
Imaging retinale weefsel kan informeren eencellige die niet kunnen worden verzameld van traditionele biochemische methoden. Dit protocol beschrijft voorbereiding van retinale segmenten van zebravis confocal imaging. Fluorescerende genetisch gecodeerd sensoren of indicator kleurstoffen toestaan visualisatie van tal van biologische processen in verschillende retinale celtypes.
Abstract
Het netvlies is een complex weefsel dat initieert en integreert de eerste stappen van de visie. Dysfunctie van netvlies cellen is een kenmerk van veel verblindende ziekten en toekomstige therapieën afhangen van fundamentele inzichten over hoe verschillende retinal cellen normaal functioneren. Verkrijgen van dergelijke informatie met de biochemische methoden heeft bewezen moeilijk, omdat de bijdragen van bepaalde celtypen in de retinale cel milieu zijn afgenomen. Live retinale imaging kan bieden een uitzicht op tal van biologische processen op een subcellular niveau, dankzij een groeiend aantal genetisch gecodeerde fluorescerende biosensoren. Deze techniek heeft tot nu toe is echter beperkt tot de kikkervisjes en larven van de zebravis, de buitenste retinale lagen van geïsoleerde netvlies, of lagere resolutie beeldvorming van het netvlies in levende dieren. Hier presenteren we een methode voor het genereren van levende ex vivo retinale segmenten van volwassen zebrafish voor levende imaging via confocale microscopie. Deze voorbereiding levert dwarse segmenten met alle retinale lagen en meeste celtypes zichtbaar zijn voor het uitvoeren van de confocal imaging experimenten met behulp van perfusie. Transgene zebrafish waarin fluorescente proteïnen of biosensoren in specifieke retinale celtypes of organellen zijn eencellige om informatie te extraheren uit een intact netvlies gebruikt. Bovendien kunnen retinale segmenten worden geladen met fluorescerende indicator kleurstoffen, toe te voegen aan veelzijdigheid van de methode. Dit protocol werd ontwikkeld voor imaging Ca2 + binnen zebrafish kegel researchdieren, maar met goede markers kan worden aangepast voor het meten van Ca2 + of metabolieten in Müller cellen, bipolaire en horizontale cellen, microglia, amacrine cellen of retinale ganglion cellen. De retinale pigment epitheel is verwijderd uit segmenten, dus deze methode niet geschikt is voor de studie van dat celtype. Met praktijk is het mogelijk voor het genereren van seriële segmenten van het ene dier voor meerdere experimenten. Deze flexibele techniek biedt een krachtig hulpmiddel voor het beantwoorden van vele vragen over retinale celbiologie, Ca2 +en energie homeostase.
Introduction
De zebravissen (Danio rerio) is geworden wijd gebruikt in medische en fundamenteel wetenschappelijk onderzoek1, wegens zijn kleine grootte, snelle ontwikkeling en gewervelde orgaansystemen. De natuurlijke transparantie van zebravis larven gecombineerd met gevestigde methodes voor Transgenese hebt ingeschakeld gedetailleerde visualisatie van cellulaire processen in een levend dier. Een aantal genetisch gecodeerde fluorescerende biosensoren zijn doelwit geweest naar specifieke zebrafish cellen om Ca2 + 2, waterstofperoxide3, apoptotic Activering4 en ATP5te detecteren.
In vivo imaging van zebravis larven heeft geleid tot de doorbraken op het gebied van de neurowetenschappen, met inbegrip van de toewijzing van hersenen circuits6 en Geneesmiddelenontwikkeling voor centrale zenuwstelsel aandoeningen7. Zebravis zijn geschikt voor onderzoek van de visie, omdat hun netvlies functie de laminaire structuur en neuron soorten hogere gewervelde dieren, en zij tonen robuuste visuele gedrag8,9. Verschillende soorten retinale degenerations analoog aan ziekten bij de mens zijn gemodelleerd met succes en studeerde in zebrafish10,11, met inbegrip van levende beeldvorming van individuele researchdieren ontaardt in een netvlies2, 12.
Terwijl in vivo larvale zebrafish imaging een waardevol instrument is, wordt het meer uitdagend als vissen groeien en ontwikkelen van pigmentatie, en sommige farmacologische behandelingen niet kunnen in een hele dier doordringen. Verder, bepaalde cellulaire processen wijzigen met ontwikkeling en leeftijd, waardoor van latere tijd punten kritiek voor begrip functie en de progressie van de ziekte bij volwassen dieren. Biochemische methoden zoals immunoblot, quantitiative PCR, O2 consumptie en metabolomic analyses kunnen belangrijke aanwijzingen over de biologie van het netvlies als geheel, maar het is moeilijk te onderscheiden van de bijdragen van individuele celtypes beïnvloed door ziekte. Geïsoleerde retinale weefsel ex vivo Imaging omzeilt deze kwesties, en terwijl imaging plat gemonteerd netvlies biedt een uitzicht over de buitenste netvlies13, diepere innerlijke retinale functies zijn verduisterd. Transversale retinal segmenten, zoals vaste immunohistochemische analyses, die worden beschreven in een duidelijk beeld van alle lagen en celtypes inschakelen maar slechts een enkele momentopname van de dynamische processen die betrokken zijn bij normale functie en ziekte bieden.
Hier presenteren we een methode voor het genereren van ex vivo dwarse retinale segmenten van volwassen zebrafish voor imaging. Het is vergelijkbaar met methoden voor amfibieën en zebrafish retinale segmenten voorbereiden elektrofysiologische en morfologische studies14,15, met belangrijke wijzigingen voor time-lapse imaging ex vivo met behulp van de confocal microscopie. Fluorescentie reacties van biosensoren of kleurstoffen in plakjes worden gecontroleerd in real-time met een confocal microscoop terwijl het leveren van farmacologische agenten met perfusie. Terwijl de methode werd ontwikkeld voor imaging-researchdieren, is het mogelijk dat het haalbaar is om het te gebruiken voor het visualiseren van Müller cellen, bipolaire cellen, horizontale cellen, amacrine cellen of retinale peesknoopcellen met passende fluorescente markeringen. Bovendien kunnen segmenten worden geladen met fluorescente cel-permeabele kleurstoffen aan de levensvatbaarheid van de cellen van het verslag, vesiculaire vervoer, mitochondriale functie of redox staat. Deze veelzijdige voorbereiding kunt visualisatie van een breed scala aan subcellular processen in het netvlies, met inbegrip van Ca2 + dynamiek, signaaltransductie en metabole staat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ex vivo beeldvorming van verse zebrafish retinale segmenten heeft bewezen als een veelzijdig instrument voor het bestuderen van fotoreceptor biologie20,21,22, en is uniek in die zin dat hierdoor analyse van afzonderlijke cellen in een volwassen, volledig gedifferentieerde netvlies. Met praktijk is het mogelijk om meerdere experimenten met weefsel van een enkele vis, zelfs met behulp van seriële segmenten uit hetzelfde …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Ralph Nelson en Daniel Possin voor doordachte oriëntatie terwijl het ontwikkelen van dit protocol, en Eva Ma, Ashley George en Gail Stanton voor generatie van stabiele transgene zebrafish lijnen. Het werk werd gesteund door de NSF GRFP 2013158531 aan M.G., NIH NEI 5T32EY007031 naar de W.C. en M.G. en EY026020 J.H. en S.B.
Materials
| zebrafish | Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility | stocks maintained in-house as stable transgenic lines | |
| petroleum jelly | Fisher Scientific | 19-090-843 | for petroleum jelly syringe |
| 3-mL slip tip syringe | Fisher Scientific | 14-823-436 | for petroleum jelly syringe |
| 20g 3.8 cm slip tip needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | for petroleum jelly syringe |
| plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for eyecup dissection, slicing chamber |
| Seche Vite clear nail polish | Amazon | B00150LT40 | for slicing chamber |
| 18 mm X 18 mm #1 glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | for imaging ladders |
| unflavored dental wax | Amazon | B01K8WNL5A | for imaging ladders |
| double edge razor blades | Stoelting | 51427 | for tissue slicing |
| tissue slicer with digital micrometer | Stoelting | 51415 | for tissue slicing |
| filter paper – white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size | EMD Millipore | HAWG01300 | filter paper for mounting retinas |
| 10 cm petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly |
| 15 cm plain-tipped wood applicator stick | Fisher Scientific | 23-400-112 | for wire eye loop tool |
| 30g (0.25 mm diameter) tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | for wire eye loop tool |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G8270 | component of supplement stock solution |
| sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | component of supplement stock solution |
| sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | component of supplement stock solution |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | component of supplement stock solution |
| L-glutathione, reduced | Sigma Aldrich | G4251 | component of supplement stock solution |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | component of supplement stock solution |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | component of Ringer's solution |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | component of Ringer's solution |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | component of Ringer's solution |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | component of Ringer's solution |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | component of Ringer's solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | component of Ringer's solution |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | component of Na+-free Ringer's solution |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 50 mL conical centrifuge tube | Denville Scientific | C1062-P | container for Ringer's solution |
| Vannas scissors – 8 cm, angled 5 mm blades | World Precision Instruments | 501790 | micro-scissors for eyecup dissection |
| Swiss tweezers – #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips | World Precision Instruments | 504510 | fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation |
| single edge razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | for eyecup dissection and trimming filter paper |
| EMD Millipore filter forceps | Fisher Scientific | XX6200006P | flat forceps for handling wet filter paper |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature |
| propidium iodide (PI) | Fisher Scientific | P3566 | stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature |
| tissue perfusion chamber | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | imaging chamber for injection or perfusion |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia |
| Olympus laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution |
| Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM |
| miniature aspirator positioner | Cell MicroControls | FL-1 | for perfusion |
| perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder | Warner Instruments | various | for perfusion |
References
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Ma, E., et al. Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors. Cell Death Dis. 4 (9), e797 (2013).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
- Andrews, N., et al. Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time. J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).
- Kioka, H., et al. Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception. Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside. Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).
- Zou, S. -. Q., Yin, W., Zhang, M. -. J., Hu, C. -. R., Huang, Y. -. B., Hu, B. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).
- Neuhauss, S. Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish. J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).
- Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).
- Gross, J., Perkins, B. Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans. Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).
- Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration. J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).
- Wang, T. -. M., Holzhausen, L., Kramer, R. Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina. Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).
- Van Hook, M., Thoreson, W. Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation. J. Vis. Exp. (76), e50007 (2013).
- Connaughton, V. Zebrafish retinal slice preparation. Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).
- Kennedy, B., et al. Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).
- George, A., et al. Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments. PLoS ONE. 9 (1), e84394 (2014).
- Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
- Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , (2015).
- Kanow, M., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, (2017).
- Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors. J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).
- Uckermann, O., et al. Selective staining by vital dyes of Müller glial cells in retinal wholemounts. Glia. 45 (1), 59-66 (2003).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current protocols in cytometry. , (2012).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), (2015).
