Ex Vivo deneyler görüntüleme için yetişkin Zebra balığı üzerinden hazırlanması taze retina dilimleri
Summary
Retina doku Imaging geleneksel biyokimyasal yöntemlerle toplanan tek hücreli bilgiler sağlar. Bu iletişim kuralı üzerinden Zebra balığı retina dilimleri hazırlanması için confocal düşsel açıklar. Floresan genetik olarak kodlanmış sensörler ve göstergesi boyalar görselleştirme çok sayıda biyolojik süreçlerin ayrı retina hücre türlerinde izin vermeyin.
Abstract
Retina, başlatır ve vizyon ilk adımları entegre karmaşık bir dokudur. Retina hücrelerinin disfonksiyon birçok kör edici hastalıklar özelliğidir ve gelecekteki tedaviler hücreleri normal çalışmasını temel anlayış üzerinde ne kadar farklı retina hakkında doğru katlayın. Katkıları belirli hücre tiplerinin retina hücre ortamda azalır çünkü bu tür bilgileri biyokimyasal yöntemlerle kazanıyor zor kanıtlamıştır. Canlı retina görüntüleme genetik olarak kodlanmış floresan biyosensörler, giderek artan sayıda sayesinde bir hücre altı düzeyde çok sayıda biyolojik süreçlerin bir görünümünü sağlar. Ancak, bu teknik şimdiye Kurbağa yavrularını ve Zebra balığı larva, izole retina en dıştaki retina katmanları veya retina Canlı hayvanlarda daha düşük çözünürlükte görüntüleme için sınırlı olmuştur. Burada confocal mikroskobu ile canlı görüntüleme için yetişkin Zebra balığı üzerinden canlı ex vivo retina dilimler oluşturmak için bir yöntem mevcut. Bu hazırlık tüm retina katmanları ve çoğu hücre tipleri confocal görüntüleme deneyler perfüzyon kullanarak gerçekleştirmek için görünür enine dilimlerle verir. Transgenik Zebra balığı ifade floresan proteinler veya belirli retina hücre tipleri veya organelleri biyosensörler sağlam bir retina tek hücreli bilgi ayıklamak için kullanılır. Ayrıca, retina dilimleri floresan göstergesi boya, yöntemin çok yönlülük için ekleme ile yüklenebilir. Bu protokol Ca2 + Zebra balığı koni photoreceptors içinde görüntüleme için geliştirilmiş, ancak uygun işaretleri ile bu Ca2 + veya metabolitleri Müller hücreleri, bipolar ve yatay hücreler, microglia, amacrine hücreleri veya retina ölçmek için adapte ganglion hücrelerinin. Bu yöntem o hücre tipi eğitim için uygun değildir bu yüzden retina pigment epiteli dilimleri kaldırılır. Uygulama ile birden çok deneyler için bir hayvan seri dilimler oluşturmak mümkündür. Bu uyarlanabilir teknik retinal hücre biyolojisi, Ca2 +ve enerji homeostazı hakkında birçok soru cevap için güçlü bir araç sağlar.
Introduction
Zebra balığı (Danio rerio) yaygın tıbbi ve temel bilimsel araştırma1, küçük boyutu, hızlı bir gelişme ve omurgalı organ sistemleri sayesinde kullanılan olmak. Zebra balığı larva transgenesis için kurulan yöntemleri ile birlikte doğal şeffaflık yaşayan hayvan hücresel süreçler ayrıntılı görselleştirme etkin. Bir dizi genetik olarak kodlanmış floresan biyosensörler Ca2 + 2, hidrojen peroksit3, apoptotik harekete geçirmek4 ve ATP5algılamak için belirli Zebra balığı hücrelere hedef almış.
Zebra balığı larva vivo içinde görüntüleme devrimler neuroscience eşleme beyin devresi6 dahil olmak üzere, alanında yol açmıştır ve ilaç geliştirme merkezi sinir sistemi için7bozuklukları. Zebra balığı vizyon araştırma için uygundur çünkü onların retina Laminer yapısı ve yüksek omurgalılarda nöron tipleri bulunmaktadır ve bunlar sağlam görsel davranışları8,9görüntüler. Retina dejenerasyonlar insan hastalığına benzer çeşitli başarıyla modellenmiş ve Zebra balığı10,11bireysel photoreceptors bir retina2içindeoluşan bozucu canlı görüntüleme dahil olmak üzere, okudu, 12.
Vivo larva Zebra balığı görüntüleme değerli bir araçtır, Balık büyüme ve gelişme pigmentasyon ve bazı farmakolojik tedaviler tüm hayvan nüfuz edemez gibi daha zor olur. Ayrıca, belirli hücresel süreçler daha sonraki zaman Puan anlayış fonksiyonu ve hastalık ilerleme için kritik yetişkin hayvanlarda yapmak geliştirme ve yaş ile değiştirme. Biyokimyasal immunoblot, quantitiative PCR, O2 tüketimi ve metabolomic analizleri gibi yöntemleri Biyoloji bir bütün olarak retina hakkında önemli ipuçları sağlayabilir, ancak katkıları etkilenen tek tek hücre tiplerinin ayırt etmek zordur hastalık. İzole retina doku ex vivo Imaging bu sorunlar atlar ve düz Imaging bağlı retina affords dış retina13bir görünümünü, daha derin iç retina özellikleri gizlenmiş. Bu içinde sunulan tüm katmanları ve hücre tipleri açık bir görünümünü etkinleştirmek immunohistokimyasal analizleri, sabit ama sadece tek bir anlık görüntü normal fonksiyon ve hastalık dahil dinamik süreçlerin teklif gibi enine retina dilimler.
Burada, görüntüleme için yetişkin Zebra balığı üzerinden ex vivo enine retina dilimler oluşturmak için bir yöntem mevcut. Elektrofizyolojik ve morfolojik araştırmalar14,15, zaman atlamalı ex vivo confocal kullanarak görüntüleme için önemli değişiklikler ile amfibi ve Zebra balığı retina dilimleri hazırlama yöntemleri benzer mikroskobu. Floresans yanıt biyosensörler veya boya dilimleri içinde gerçek zamanlı olarak farmakolojik ajanlar perfüzyon kullanarak teslim ederken confocal mikroskop ile izlenir. Yöntem photoreceptors görüntüleme için geliştirilmiş olsa da, Müller hücre, iki kutuplu hücreler, yatay hücreler, amacrine hücreleri veya retina ganglion hücrelerinin uygun floresan işaretleri ile görüntülenmesi için kullanmak için uygun olabilir. Ayrıca, dilimleri rapor hücre canlılığı, veziküler ulaşım, mitokondri işlev veya Redoks devlet hücre geçirgen floresan boyalar ile yüklenebilir. Bu çok yönlü hazırlık Ca2 + dinamikleri, sinyal iletimi ve metabolik durumu da dahil olmak üzere retina hücre altı işlemleri geniş bir görselleştirme sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ex vivo görüntüleme taze Zebra balığı retina dilim photoreceptor Biyoloji20,21,22eğitim için çok yönlü bir araç olduğu kanıtlanmıştır ve çözümleme olgun, tek hücre tam sağlar benzersizdir farklılaştırılmış retina. Uygulama ile hatta retina aynı kısmından seri dilimleri kullanarak tek bir balık dokudan ile birden çok deney mümkündür. Sorunlar ve öneriler Elektrofizyoloji çalışmalar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Ralph Nelson ve Daniel Possin geliştirilmesi istikrarlı transgenik Zebra balığı satırları oluşturmak için bu iletişim kuralı ve Eva Ma, Ashley George ve Gail Stanton ise düşünceli rehberlik için teşekkür ederiz. İş M.G., NIH NEI 5T32EY007031 W.C. ve M.G. için NSF GRFP 2013158531 ve EY026020 J.H. ve SB tarafından desteklenmiştir
Materials
| zebrafish | Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility | stocks maintained in-house as stable transgenic lines | |
| petroleum jelly | Fisher Scientific | 19-090-843 | for petroleum jelly syringe |
| 3-mL slip tip syringe | Fisher Scientific | 14-823-436 | for petroleum jelly syringe |
| 20g 3.8 cm slip tip needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | for petroleum jelly syringe |
| plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for eyecup dissection, slicing chamber |
| Seche Vite clear nail polish | Amazon | B00150LT40 | for slicing chamber |
| 18 mm X 18 mm #1 glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | for imaging ladders |
| unflavored dental wax | Amazon | B01K8WNL5A | for imaging ladders |
| double edge razor blades | Stoelting | 51427 | for tissue slicing |
| tissue slicer with digital micrometer | Stoelting | 51415 | for tissue slicing |
| filter paper – white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size | EMD Millipore | HAWG01300 | filter paper for mounting retinas |
| 10 cm petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly |
| 15 cm plain-tipped wood applicator stick | Fisher Scientific | 23-400-112 | for wire eye loop tool |
| 30g (0.25 mm diameter) tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | for wire eye loop tool |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G8270 | component of supplement stock solution |
| sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | component of supplement stock solution |
| sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | component of supplement stock solution |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | component of supplement stock solution |
| L-glutathione, reduced | Sigma Aldrich | G4251 | component of supplement stock solution |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | component of supplement stock solution |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | component of Ringer's solution |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | component of Ringer's solution |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | component of Ringer's solution |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | component of Ringer's solution |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | component of Ringer's solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | component of Ringer's solution |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | component of Na+-free Ringer's solution |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 50 mL conical centrifuge tube | Denville Scientific | C1062-P | container for Ringer's solution |
| Vannas scissors – 8 cm, angled 5 mm blades | World Precision Instruments | 501790 | micro-scissors for eyecup dissection |
| Swiss tweezers – #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips | World Precision Instruments | 504510 | fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation |
| single edge razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | for eyecup dissection and trimming filter paper |
| EMD Millipore filter forceps | Fisher Scientific | XX6200006P | flat forceps for handling wet filter paper |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature |
| propidium iodide (PI) | Fisher Scientific | P3566 | stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature |
| tissue perfusion chamber | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | imaging chamber for injection or perfusion |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia |
| Olympus laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution |
| Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM |
| miniature aspirator positioner | Cell MicroControls | FL-1 | for perfusion |
| perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder | Warner Instruments | various | for perfusion |
References
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Ma, E., et al. Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors. Cell Death Dis. 4 (9), e797 (2013).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
- Andrews, N., et al. Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time. J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).
- Kioka, H., et al. Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception. Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside. Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).
- Zou, S. -. Q., Yin, W., Zhang, M. -. J., Hu, C. -. R., Huang, Y. -. B., Hu, B. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).
- Neuhauss, S. Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish. J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).
- Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).
- Gross, J., Perkins, B. Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans. Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).
- Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration. J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).
- Wang, T. -. M., Holzhausen, L., Kramer, R. Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina. Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).
- Van Hook, M., Thoreson, W. Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation. J. Vis. Exp. (76), e50007 (2013).
- Connaughton, V. Zebrafish retinal slice preparation. Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).
- Kennedy, B., et al. Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).
- George, A., et al. Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments. PLoS ONE. 9 (1), e84394 (2014).
- Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
- Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , (2015).
- Kanow, M., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, (2017).
- Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors. J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).
- Uckermann, O., et al. Selective staining by vital dyes of Müller glial cells in retinal wholemounts. Glia. 45 (1), 59-66 (2003).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current protocols in cytometry. , (2012).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), (2015).
