Preparazione fette fresche della retina dallo Zebrafish adulto per Ex Vivo Imaging esperimenti
Summary
Formazione immagine del tessuto retinico può fornire informazioni di cella singola che non possono essere raccolti dai metodi biochimici tradizionali. Questo protocollo descrive la preparazione delle fette della retina dallo zebrafish per imaging confocale. Fluorescenti geneticamente codificati sensori o indicatore coloranti permettono la visualizzazione di numerosi processi biologici in tipi distinti delle cellule retiniche.
Abstract
La retina è un tessuto complesso che avvia e integra i primi passi della visione. Disfunzione delle cellule retiniche è un segno distintivo di molte malattie accecante, e terapie future cerniera su fondamentali comprensioni circa retinico come le diverse cellule di funzionano normalmente. L’acquisizione di tali informazioni con metodi biochimici ha dimostrato difficile perché i contributi di tipi delle cellule particolari sono diminuiti nell’ambiente delle cellule retiniche. Live imaging retinico può fornire una visualizzazione di numerosi processi biologici a livello subcellulare, grazie a un numero crescente di biosensori fluorescenti geneticamente codificati. Tuttavia, questa tecnica è stato finora limitata a girini e larve di zebrafish, gli strati retinici esterni di retine isolate o immagine in alta risoluzione inferiore delle retine in animali vivi. Qui presentiamo un metodo per la generazione diretta ex vivo retinica fette dallo zebrafish adulto per l’imaging dal vivo tramite microscopia confocale. Questa preparazione produce in sezioni trasversali con tutti gli strati della retina e la maggior parte dei tipi di cellule visibili per l’esecuzione di esperimenti di imaging confocale mediante perfusione. Zebrafish transgenici esprimenti le proteine fluorescenti o biosensori in tipi specifici delle cellule retiniche o organelli vengono utilizzate per estrarre informazioni di cella singola da una retina intatta. Inoltre, fette della retina possono essere caricati con indicatore fluorescente tinture, aggiungendo alla versatilità del metodo. Questo protocollo è stato sviluppato per l’imaging di Ca2 + all’interno di fotorecettori cono zebrafish, ma con gli indicatori di corretta potrebbe essere adattato per misurare Ca2 + o metaboliti Müller cells, cellule bipolari e orizzontali, microglia, cellule amacrine, o retinica cellule del ganglio. L’epitelio pigmentato retinico è rimosso dalle fette quindi questo metodo non è adatto per lo studio di tale tipo di cella. Con la pratica, è possibile generare fette di serie da un animale per esperimenti multipli. Questa tecnica adattabile fornisce un potente strumento per rispondere alle tante domande sulla biologia delle cellule retiniche, Ca2 +e l’omeostasi energetica.
Introduction
Il danio zebrato (Danio rerio) diventare ampiamente utilizzato nella ricerca scientifica medica e base1, grazie alla sua piccola dimensione, rapido sviluppo e sistemi dell’organo dei vertebrati. La naturale trasparenza delle larve di zebrafish combinati con metodi stabiliti per transgenesi hanno permesso la visualizzazione dettagliata dei processi cellulari in un animale vivente. Un numero di biosensori fluorescenti geneticamente codificati è stati presi di mira alle cellule di zebrafish specifico per rilevare il Ca2 + 2, perossido di idrogeno3, apoptotico attivazione4 e ATP5.
In vivo imaging delle larve di zebrafish ha portato innovazioni nel campo delle neuroscienze, tra cui la mappatura del cervello circuito6 e7di disturbi dello sviluppo del farmaco per il sistema nervoso centrale. Zebrafish sono adatti per ricerca sulla visione, perché le loro retine presentano la struttura laminare e tipi di neurone dei vertebrati superiori, e mostrano comportamenti visual robusto8,9. Diversi tipi di degenerazioni retiniche analoghe alla malattia umana sono stati modellati con successo e ha studiati in zebrafish10,11, compreso formazione immagine diretta dei singoli fotorecettori che degenera in una retina2, 12.
Mentre in vivo imaging larvale zebrafish è uno strumento prezioso, diventa più difficile come pesci crescono e si sviluppano pigmentazione, e alcuni trattamenti farmacologici non possono superare un animale intero. Ulteriormente, alcuni processi cellulari cambiano con lo sviluppo e l’età, rendendo più tardi tempo punti critici per la funzione di comprensione e la progressione della malattia negli animali adulti. Metodi biochimici quali immunoblot, quantitative PCR, il consumo di O2 e analisi metabolomica possono fornire importanti indizi sulla biologia della retina nel suo complesso, ma è difficile discernere contributi singoli tipi di cellule colpiti da malattia. Tessuto retinico isolato ex vivo di imaging consente di ignorare questi problemi e mentre imaging piatto montate retine offre una vista della retina esterna13, funzionalità retinica interna più profonda sono oscurati. Le sezioni trasversali retiniche, come quelli presentati fissa le analisi di immunohistochemical, permettono una visione chiara di tutti i livelli e tipi di cellule, ma offrono solo un singolo snapshot dei processi dinamici coinvolti nella malattia e nella funzione normale.
Qui, presentiamo un metodo per la generazione ex vivo sezioni trasversali retiniche dallo zebrafish adulto per l’imaging. È simile ai metodi per la preparazione di fette retiniche anfibio e zebrafish per studi elettrofisiologici e morfologici14,15, con importanti modifiche per time lapse imaging ex vivo mediante confocale microscopia. Le risposte di fluorescenza di biosensori o coloranti a fette sono monitorate in tempo reale con un microscopio confocale offrendo agenti farmacologici mediante perfusione. Mentre il metodo è stato sviluppato per l’imaging di fotorecettori, può essere fattibile per utilizzarlo per la visualizzazione di celle Müller, cellule bipolari, cellule orizzontali, cellule amacrine o cellule retiniche del ganglio con appropriati marcatori fluorescenti. Inoltre, le fette possono essere caricati con coloranti fluorescenti cellula-permeabile di attuabilità delle cellule di relazione, trasporto vescicolare, funzione mitocondriale o stato redox. Questa preparazione versatile permette la visualizzazione di una vasta gamma di processi subcellulare in tutta la retina, tra cui Ca2 + dinamiche, trasduzione del segnale e dello stato metabolico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ex vivo imaging di zebrafish fresco fette retinica ha dimostrato di essere un versatile strumento per lo studio del fotoricettore biologia20,21,22ed è unico in quanto permette l’analisi delle singole cellule in un maturo, completamente retina differenziato. Con la pratica, è possibile condurre esperimenti multipli con il tessuto da un singolo pesce, utilizzando anche fette di serie dalla stessa parte della retina. Olt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Ralph Nelson e Daniel Possin per guida premurosa durante lo sviluppo di questo protocollo ed Eva Ma, Ashley George e Gail Stanton per la generazione di linee di zebrafish transgenici stabile. Il lavoro è stato supportato da NSF GRFP 2013158531 a M.G., 5T32EY007031 NIH NEI W.C. e M.G. ed EY026020 di J.H. e S.B.
Materials
| zebrafish | Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility | stocks maintained in-house as stable transgenic lines | |
| petroleum jelly | Fisher Scientific | 19-090-843 | for petroleum jelly syringe |
| 3-mL slip tip syringe | Fisher Scientific | 14-823-436 | for petroleum jelly syringe |
| 20g 3.8 cm slip tip needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | for petroleum jelly syringe |
| plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for eyecup dissection, slicing chamber |
| Seche Vite clear nail polish | Amazon | B00150LT40 | for slicing chamber |
| 18 mm X 18 mm #1 glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | for imaging ladders |
| unflavored dental wax | Amazon | B01K8WNL5A | for imaging ladders |
| double edge razor blades | Stoelting | 51427 | for tissue slicing |
| tissue slicer with digital micrometer | Stoelting | 51415 | for tissue slicing |
| filter paper – white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size | EMD Millipore | HAWG01300 | filter paper for mounting retinas |
| 10 cm petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly |
| 15 cm plain-tipped wood applicator stick | Fisher Scientific | 23-400-112 | for wire eye loop tool |
| 30g (0.25 mm diameter) tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | for wire eye loop tool |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G8270 | component of supplement stock solution |
| sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | component of supplement stock solution |
| sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | component of supplement stock solution |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | component of supplement stock solution |
| L-glutathione, reduced | Sigma Aldrich | G4251 | component of supplement stock solution |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | component of supplement stock solution |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | component of Ringer's solution |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | component of Ringer's solution |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | component of Ringer's solution |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | component of Ringer's solution |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | component of Ringer's solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | component of Ringer's solution |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | component of Na+-free Ringer's solution |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 50 mL conical centrifuge tube | Denville Scientific | C1062-P | container for Ringer's solution |
| Vannas scissors – 8 cm, angled 5 mm blades | World Precision Instruments | 501790 | micro-scissors for eyecup dissection |
| Swiss tweezers – #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips | World Precision Instruments | 504510 | fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation |
| single edge razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | for eyecup dissection and trimming filter paper |
| EMD Millipore filter forceps | Fisher Scientific | XX6200006P | flat forceps for handling wet filter paper |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature |
| propidium iodide (PI) | Fisher Scientific | P3566 | stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature |
| tissue perfusion chamber | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | imaging chamber for injection or perfusion |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia |
| Olympus laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution |
| Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM |
| miniature aspirator positioner | Cell MicroControls | FL-1 | for perfusion |
| perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder | Warner Instruments | various | for perfusion |
References
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Ma, E., et al. Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors. Cell Death Dis. 4 (9), e797 (2013).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
- Andrews, N., et al. Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time. J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).
- Kioka, H., et al. Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception. Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside. Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).
- Zou, S. -. Q., Yin, W., Zhang, M. -. J., Hu, C. -. R., Huang, Y. -. B., Hu, B. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).
- Neuhauss, S. Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish. J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).
- Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).
- Gross, J., Perkins, B. Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans. Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).
- Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration. J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).
- Wang, T. -. M., Holzhausen, L., Kramer, R. Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina. Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).
- Van Hook, M., Thoreson, W. Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation. J. Vis. Exp. (76), e50007 (2013).
- Connaughton, V. Zebrafish retinal slice preparation. Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).
- Kennedy, B., et al. Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).
- George, A., et al. Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments. PLoS ONE. 9 (1), e84394 (2014).
- Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
- Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , (2015).
- Kanow, M., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, (2017).
- Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors. J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).
- Uckermann, O., et al. Selective staining by vital dyes of Müller glial cells in retinal wholemounts. Glia. 45 (1), 59-66 (2003).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current protocols in cytometry. , (2012).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), (2015).
