JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

Рентгенофлуоресцентного капиллярного электрофореза масс-спектрометрии для метаболомики одноклеточных в жить лягушки (Xenopus laevis) эмбрионов

Published: December 22, 2017
doi:
10.3791/56956
, , ,
1Department of Chemistry,George Washington University, 2Department of Anatomy & Regenerative Biology,George Washington University, 3Department of Chemistry & Biochemistry,University of Maryland, College Park

Summary

Мы описать шаги, которые позволяют быстро в situ выборки небольшой части отдельной ячейки с высокой точностью и минимальным вторжением, используя капиллярно основе микро выборки, для облегчения химических характеристик снимка метаболической активности в живой эмбрионов, с помощью заказных одноклеточного капиллярного электрофореза и масс-спектрометрии платформы.

Abstract

Количественная оценка малых молекул в одиночных клетках порождает новые возможности для лучшего понимания основных процессов, которые лежат в основе развития эмбриона. Чтобы включить одноклеточных расследований непосредственно в жить эмбрионов, новые аналитические подходы необходимы, особенно те, которые чувствительны, селективный, количественных, надежных и масштабируемых размеров различных клеток. Здесь мы представляем протокол, который позволяет проводить анализ в situ метаболизма в одиночных клетках в свободно развивающихся эмбрионов Южной Африки когтистые лягушки (Xenopus laevis), мощная модель в клетке и биологии развития. Этот подход использует капиллярную рентгенофлуоресцентного аспирационная определенную часть от одного выявленных клеток эмбриона, оставляя нетронутыми для последующего анализа соседние клетки. Содержимое ячейки собранных анализируемой микромасштабной капиллярного электрофореза электроспрей ионизации (CE-ESI) интерфейса в сочетании с высоким разрешением тандемные масс-спектрометр. Этот подход является масштабируемой для различных размеров ячеек и совместимы с сложной трехмерной структуры развивающихся эмбрионов. В качестве примера мы показываем, что рентгенофлуоресцентного одноклеточных CE-ЭСИ-MS позволяет разяснения метаболизм клеток неоднородность, которая разворачивается как прогениторных клеток приводит к потомкам во время развития эмбриона. Помимо клеток и биологии развития анализ одноклеточных протоколы, описанные здесь поддаются других размеров ячеек, типов клеток или Животные модели.

Introduction

Полное понимание эмбрионального развития требует характеристика всех молекулярных изменений, которые разворачиваются в каждой клетке организма развивающихся. Во время следующего поколения виртуализации с молекулярной усиления позволяет глубокое измерение1 одной ячейки transcriptomes в разработке систем2,3, значительно меньше известно о набор мелких молекул производится в одном эмбриональных клеток, включая белки и, особенно, метаболитов (молекулярная масса < да ~ 1500). Быстрый и динамичный ответ на внутренние и внешние события метаболом служит мощным дескрипторов молекулярной состояния клеток. Метаболом одноклеточных, таким образом, повышает потенциал для отслеживания развития пространственной и временной гетерогенности клеток в раннего эмбриона и выявления новых молекул для функциональных исследований. Однако без молекулярной усилители для этих молекул, обнаружение метаболом требует исключительной чувствительности с помощью масс-спектрометрия (МС), который является технология, которая выбирается для анализа метаболит.

Одноклеточных MS — это совокупность технологий с достаточной чувствительностью, чтобы измерить метаболитов в одиночных клетках (см. обзоры 4,5,6,,78,9 ,10,11,12,13,14,15). Воспроизводимость проб клеток и эффективного экстракции метаболитов важны для успешного обнаружения метаболитов в одиночных клетках. Рассечение поклеточного выявленных клеток от зародыши Xenopus позволил характеристика малых молекул и пептиды16. Другие подходы использовать micropipettes для выборки отдельных живых клеток, после обнаружения с помощью электроспрей ионизации (ESI) МС. Например метаболитов были измеряется в завод или mammalian клеток одноклеточных видео MS17, зонд давления18, один зонд19и оптимизированных силы микроскопии20, среди других методов21, 22,23,24. Кроме того включение химического разделения до ионизации в рабочий процесс MS одноклеточных эффективно упрощает метаболом, облегчая потенциальных помех во время Ион поколения до обнаружения. Важно отметить, что разделение также предоставляет соединение специфичной информации для оказания помощи в молекулярной идентификации. Капиллярный электрофорез (CE) был использован для обнаружения метаболитов в один расчлененный25,26 или microsampled27нейронов, захватив мелкомолекулярных различия между нейрон фенотипов. Недавно мы адаптировали CE ESI тандем MS для включения трассировки уровня обнаружение сотен метаболитов в отдельных клетках, которые были расчленены от ранних зародыши Xenopus laevis16,28. Эти исследования показали удивительно метаболических различия между эмбриональных клеток на ранней стадии развития и привели к открытию метаболитов с ранее неизвестных последствий развития16.

Здесь мы предоставляем протокол, что включено обнаружение метаболитов в одиночных клетках непосредственно в жить позвоночных эмбриона с помощью микрозондирования одноклеточных CE-ЭСИ-MS29,30. Модельный организм выбрали является 8-к-32-клеток эмбриона X. laevis , хотя подход применяется также в более поздних стадиях развития и другие виды модельных организмов. Этот протокол использует заостренный капилляров с поступательной управления многоосных под руководством системой с высоким разрешением изображений для аспирационная ~ 10 nL часть выявленных клетки в situ в морфологически комплекс развивающегося эмбриона. Этот рентгенофлуоресцентного масштабируется для мелких клеток и действует в течение нескольких секунд, который достаточно быстро, чтобы отслеживать линий клеток эмбриона. После извлечения полярных или apolar малых молекул, таких как метаболиты и пептиды, из собранных образцов в ~ 4-5 мкл экстракции раствор, ~ 10 nL полученный экстракт анализируется в заказных платформе CE через дефис масс-спектрометр для ESI. Строительства и эксплуатации платформы CE-ЭСИ-МС основывается на протоколы, описанные в других местах. 31 , 32 co-axial CE-ESI интерфейс построен как описано в других местах. 31 в конус Джет напыления режима для достижения уровня трассировки чувствительность с возможностью для количественной оценки через динамический диапазон журнала порядка 4-5 (относительная28,29,30 поддерживается эта платформа или абсолютной16). CE-ЭСИ-MS платформа предлагает 60-amol нижний предел обнаружения с 8%, относительная стандартное отклонение (ОСБ) в количественный проверенных диапазоне 10 Нм до 1 мкм для малых молекул16, которые являются достаточными для характеристики эндогенного метаболитов в X. laevis клеток. Microprobed клетки продолжают делить как зародыш прогрессирует через развитие30, позволяющие решить височно и пространственно анализ клеточного метаболизма. Действительно одноклеточных CE-ЭСИ-MS может использоваться для поиска метаболических различия между ячейками, которые занимают спинной вентральный16,29, животных растительный16и слева направо28 развития осей, а также клетки которые формируют суждено дорсальной линии нервной ткани от общей прародитель ячейки в X. laevis30. Кроме запроса метаболических различия между отдельными эмбриональных клеток на разных этапах своего развития эмбриона X. laevis 30, мы ожидаем, что протоколы, описанные здесь, применимы к широкому кругу биомолекул и отдельные клетки microsampled от различных стадий эмбрионального развития, а также другие типы клеток и модельных организмов. Кроме того рентгенофлуоресцентного может использоваться для microsampling, в то время как различные платформы, совместим с незначительной образцы могут быть использованы для разделения и/или характеристика биомолекул.

Protocol

Все протоколы, связанные с поддержанием и обработки Xenopus laevis были утверждены институциональный уход животных и использования Комитетом в университете Джорджа Вашингтона (IACUC нет. A311). 1. подготовка проб инструменты, средства массовой информации, растворители и блюда</p…

Representative Results

Мы недавно занятых рентгенофлуоресцентного одноклеточных CE-ЭСИ-МС для характеристики метаболитов в отдельных определенных ячеек в свободно развивающиеся зародыши Xenopus laevis 29,30. Рентгенофлуоресцентного позволяет быстро (~ 5 сек/cell), …

Discussion

Рентгенофлуоресцентного CE-ЭСИ-MS позволяет прямой характеристика метаболитов в одиночных клетках в прямом эфире, свободно развивающихся эмбрионов. В центре подхода находятся два технических подкомпонентов, а именно в situ капиллярного microsampling и высок чувствительности CE-ЭСИ-г-жа по ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана национальными институтами здравоохранения грантов GM114854 (чтобы п.н.) и CA211635 (для п.н.), Арнольд и Мейбл Бекман фонд Бекман молодой следователь предоставить (п.н.), премия DuPont молодой профессор (чтобы п.н.), Американское общество для массы Спектрометрия исследований премии (п.н.) и космос клуб фонд стипендий (R.M.O. и E.P.P.). Мнения и выводы, содержащиеся в настоящей публикации являются исключительно мнениями авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения источников финансирования.

Materials

Reagents for Embryo Culture Media
Potasium chloride Fisher Scientific BP 366-1
Magnesium sulfate Fisher Scientific M 65-3
Calcium nitrate Sigma Aldrich C1396
Cysteine MP Biomedicals 101444
Trizma hydrochloride Sigma Aldrich T3253
Trizma base Sigma Aldrich T1503
Sodium chloride Fisher Scientific 5641-212
Name Company Catalog Number Comments
Metabolite Extraction Solvents
Acetonitrile (LC-MS-grade) Fisher Scientific A955
Methanol (LC-MS-grade) Fisher Scientific A456
Water (LC-MS-grade) Fisher Scientific W6
Name Company Catalog Number Comments
Solvents and Standards for CE-ESI-MS
Formic acid (LC-MS-grade) Fisher Scientific A11710X1-AMP
Methanol (LC-MS-grade) Fisher Scientific A456-4
Water (LC-MS-grade) Fisher Scientific W6
Sodium chloride Fisher Scientific 5641-212
Acetylcholine chloride Acros Organics 159170050
Name Company Catalog Number Comments
Microprobe Fabrication Setup
Micropippette puller Sutter Instrument Co. P-1000
Borosilicate capillaries Sutter Instrument Co. B100-50-10
Fine sharp forceps: Dumont #5, Biologie/Dumoxel Fine Science Tools (USA) Inc 11252-30 Corrosion resitant and autoclavable.
Name Company Catalog Number Comments
Microprobe Sampling Setup
Micromanipulator Eppendorf, Hauppauge, NY TransferMan 4r
Stereomicroscope Nikon SMZ18 Should be vibrationally isolated.
Illuminator e.g. Goosenecks Nikon C-FLED2
Microinjector Warner Instrument, Handem, CT PLI-100A
Transfer pipettes (Plastic, disposable) Fisher Scientific 13-711-7M
Petri dish 60 mm and 80 mm Fisher Scientific S08184
Glass Pasteur Pipets ( Borosilicate, disposable) Fisher Scientific 13-678-20A
Centrifuge Thermo Scientific Sorvall Legend X1R
Name Company Catalog Number Comments
CE-ESI-MS Setup
High voltage power supply Spellman CZE1000R The HVPS may be controlled remotely using a low-voltage program generated by a personal computer. Caution: High voltage presents electrical shock hazard; all connective parts must be grounded or carefully shielded to prevent users from accidental exposure.
Syringe pumps (2) Harvard Apparatus 704506
Stereomicroscope Amscope SM-3BZZ Stereomicroscope capable of 4.5× magnification, equipped with an illuminator to monitor the spraying mode of the CE-ESI interface.
XYZ translation stage Thorlabs PT3
XYZ translation stage Custom-built This platform is capable of loading nanoliter-amounts of sample into the separation capillary via hydrodynamic injection and supplying the BGE for CE. Both interfaces described in this work were able to inject 6–10 nL of sample within 1 min into a 1 m separation capillary
Stainless steel sample vials Custom-built
Stainless steel BGE vial Custom-built
Fused silica capillary (40 µm/105 µm ID/OD; 100 cm) Polymicro technologies TSP040105
Fused silica capillary (75 µm/360 µm ID/OD; 100 cm) Polymicro technologies TSP075375
Stainless steel emitter with blunt tips (130/260 µm ID/OD) Hamilton Co. 21031A For better performance, laser-cleave and fine-polish the emitter tip.
Syringes (gas-tight): 500 – 1000 µL Hamilton Co. 1750TTL
Digital multimeter Fluke Fluke 117
High-resolution Mass Spectrometer Bruker Daltonics Maxis Impact HD High-resolution tandem mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure interface configured for ESI
Tunning mixture for mass spectrometer calibration Agilent technologies ESI-L G1969-85000
Data Analysis ver. 4.3 software Bruker Daltonics
Name Company Catalog Number Comments
Ancillary Equipment
Vacuum concentrator capable of operation at 4–10°C Labconco 7310022
Analytical microbalance (XSE105DU) Fisher Scientific 01911005
Freezer (-20 °C) Fisher Scientific 97-926-1
Freezer (-80 °C) Fisher Scientific 88300ASP
Refrigerated Incubator Fisher Scientific 11475126
Vortex-mixer Benchmark BS-VM-1000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tang, F. C., Lao, K. Q., Surani, M. A. Development and applications of single-cell transcriptome analysis. Nat. Methods. 8 (4), S6-S11 (2011).
  2. Veselovska, L., et al. Deep sequencing and de novo assembly of the mouse oocyte transcriptome define the contribution of transcription to the DNA methylation landscape. Genome Biol. 16 (209), (2015).
  3. Tran, D. A., Bai, A. Y., Singh, P., Wu, X. W., Szabo, P. E. Characterization of the imprinting signature of mouse embryo fibroblasts by RNA deep sequencing. Nucleic Acids Res. 42 (3), 1772-1783 (2014).
  4. Wang, D. J., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in ‘omics’. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
  5. Svatos, A. Single-cell metabolomics comes of age: new developments in mass spectrometry profiling and imaging. Anal. Chem. 83 (13), 5037-5044 (2011).
  6. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nat. Methods. 8 (4), S20-S29 (2011).
  7. Bodenmiller, B., et al. Multiplexed mass cytometry profiling of cellular states perturbed by small-molecule regulators. Nat. Biotechnol. 30 (9), 858-889 (2012).
  8. Rubakhin, S. S., Lanni, E. J., Sweedler, J. V. Progress toward single cell metabolomics. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (1), 95-104 (2013).
  9. Kleparnik, K., Foret, F. Recent advances in the development of single cell analysis: A review. Anal. Chim. Acta. 800, 12-21 (2013).
  10. Zenobi, R. Single-cell metabolomics: Analytical and biological perspectives. Science. 342 (6163), 1243259 (2013).
  11. Gholipour, Y., Erra-Balsells, R., Nonami, H. In situ pressure probe sampling and UV-MALDI MS for profiling metabolites in living single cells. Mass Spectrom (Tokyo). 1 (1), A0003 (2012).
  12. Comi, T. J., Do, T. D., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Categorizing cells on the basis of their chemical profiles: progress in single-cell mass spectrometry. J. Am. Chem. Soc. 139 (11), 3920-3929 (2017).
  13. Lombard-Banek, C., Portero, E. P., Onjiko, R. M., Nemes, P. New-generation mass spectrometry expands the toolbox of cell and developmental biology. Genesis. 55, e23012 (2017).
  14. Yang, Y. Y., et al. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. Trac-Trends Anal. Chem. 90, 14-26 (2017).
  15. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
  16. Onjiko, R. M., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry reveals small molecules that affect cell fates in the 16-cell embryo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (21), 6545-6550 (2015).
  17. Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. J. Mass Spectrom. 43 (12), 1692-1700 (2008).
  18. Nakashima, T., et al. Single-cell metabolite profiling of stalk and glandular cells of intact trichomes with internal electrode capillary pressure probe electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 88 (6), 3049-3057 (2016).
  19. Pan, N., et al. The single-probe: A miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Anal. Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).
  20. Guillaume-Gentil, O., et al. Single-cell mass spectrometry of metabolites extracted from live cells by fluidic force microscopy. Anal. Chem. 89 (9), 5017-5023 (2017).
  21. Saha-Shah, A., Green, C. M., Abraham, D. H., Baker, L. A. Segmented flow sampling with push-pull theta pipettes. Analyst. 141 (6), 1958-1965 (2016).
  22. Hu, J., et al. Synchronized polarization induced electrospray: Comprehensively profiling biomolecules in single cells by combining both positive-ion and negative-ion mass spectra. Anal. Chem. 88 (14), 7245-7251 (2016).
  23. Zhang, L. W., Vertes, A. Energy charge, redox state, and metabolite turnover in single human hepatocytes revealed by capillary microsampling mass spectrometry. Anal. Chem. 87 (20), 10397-10405 (2015).
  24. Zhang, L. W., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
  25. Lapainis, T., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Capillary electrophoresis with electrospray ionization mass spectrometric detection for single-cell metabolomics. Anal. Chem. 81 (14), 5858-5864 (2009).
  26. Nemes, P., Knolhoff, A. M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Metabolic differentiation of neuronal phenotypes by single-cell capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 83 (17), 6810-6817 (2011).
  27. Aerts, J. T., et al. Patch clamp electrophysiology and capillary electrophoresis mass spectrometry metabolomics for single cell characterization. Anal. Chem. 86 (6), 3203-3208 (2014).
  28. Onjiko, R. M., Morris, S. E., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry with multi-solvent extraction identifies metabolic differences between left and right blastomeres in the 8-cell frog (Xenopus) embryo. Analyst. 141 (12), 3648-3656 (2016).
  29. Onjiko, R. M., Plotnick, D. O., Moody, S. A., Nemes, P. Metabolic comparison of dorsal versus ventral cells directly in the live 8-cell frog embryo by microprobe single-cell CE-ESI-MS. Anal. Methods. , (2017).
  30. Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. In situ microprobe single-cell capillary electrophoresis mass spectrometry: Metabolic reorganization in single differentiating cells in the live vertebrate (Xenopus laevis) embryo. Anal. Chem. 89, 7069-7076 (2017).
  31. Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nat. Protoc. 8 (4), 783-799 (2013).
  32. Knolhoff, A. M., Nemes, P., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V., Wevers, R., Lutz, N., Sweedler, J. V. . Methodologies for Metabolomics. , 119-139 (2013).
  33. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2000).
  34. Moody, S. A. Cell lineage analysis in Xenopus embryos. Methods Mol Biol. 135, 331-347 (2000).
  35. Bowes, J. B., et al. Xenbase: a Xenopus biology and genomics resource. Nucleic Acids Res. 36, D761-D767 (2008).
  36. Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43 (D1), D756-D763 (2015).
  37. James-Zorn, C., et al. Xenbase: expansion and updates of the Xenopus model organism database. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D865-D870 (2013).
  38. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
  39. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
  40. Dale, L., Slack, J. M. W. Fate map for the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 99 (4), 527-551 (1987).
  41. Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Dev. Biol. 120 (1), 299-304 (1987).
  42. Rollman, C. M., Moini, M. Ultrafast capillary electrophoresis/mass spectrometry of controlled substances with optical isomer separation in about a minute. Rapid Commun. Mass Spectrom. 30 (18), 2070-2076 (2016).
  43. Moini, M., Martinez, B. Ultrafast capillary electrophoresis/mass spectrometry with adjustable porous tip for a rapid analysis of protein digest in about a minute. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (3), 305-310 (2014).
  44. Huhn, C., Ramautar, R., Wuhrer, M., Somsen, G. W. Relevance and use of capillary coatings in capillary electrophoresis-mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 396 (1), 297-314 (2010).
  45. Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays. Anal. Chem. 79 (8), 3105-3116 (2007).
  46. Zhu, Z. J., et al. Liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry characterization of metabolites guided by the METLIN database. Nat. Protoc. 8 (3), 451-460 (2013).
  47. Wishart, D. S., et al. HMDB 3.0 The Human Metabolome Database in 2013. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D801-D807 (2013).
  48. Liu, J. X., Aerts, J. T., Rubakhin, S. S., Zhang, X. X., Sweedler, J. V. Analysis of endogenous nucleotides by single cell capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analyst. 139 (22), 5835-5842 (2014).
  49. Hubrecht, L., Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1967).
  50. Grant, P. A., Herold, M. B., Moody, S. A. Blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development. J. Vis. Exp. (71), (2013).
  51. Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nat. Protoc. 6 (8), 1241-1249 (2011).

Tags

MicroprobeCapillary ElectrophoresisMass SpectrometrySingle-cell MetabolomicsLive FrogXenopus LaevisEmbryosIn Situ MicrosamplingCell BiologyDevelopmental BiologyMinimally Invasive SamplingAgarose GelPasteur PipetteBorosilicate CapillariesFlaming/Brown Type Capillary PullerDejellyingSteinberg’s SolutionGonadotropinIn Vitro Fertilization

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos. J. Vis. Exp. (130), e56956, doi:10.3791/56956 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image