Microprobe capillaire elektroforese massaspectrometrie voor eencellige metabolomica in Live kikker (Xenopus laevis) embryo 's

Een grondig inzicht in de embryonale ontwikkeling vereist karakterisering van alle moleculaire veranderingen die in elke cel van het ontwikkelende organisme ontvouwen. Next-Generation Sequencing met moleculaire versterking maakt diepe meting van eencellige transcriptomes¹ in ontwikkelende systemen^2,3, aanzienlijk minder is bekend over de suite van kleinere moleculen geproduceerd in één embryonale cellen, met inbegrip van eiwitten en, vooral, metabolieten (moleculaire massa < ~ 1.500 Da). Met een snelle en dynamische respons op intrinsieke en extrinsieke gebeurtenissen fungeert de metabolome als een krachtige descriptor van moleculaire staat van een cel. De eencellige metabolome, roept daarom de mogelijkheden voor het bijhouden van de ruimtelijke en temporele ontwikkeling van cel heterogeniteit in de vroege embryo en identificeren van nieuwe moleculen voor functionele studies. Echter zonder moleculaire amplificatie beschikbaar voor deze moleculen vraagt detectie van de metabolome om uitzonderlijke gevoeligheid met behulp van spectrometrie van de massa (MS), die is de technologie van de keuze voor metaboliet analyse.

Eencellige MS is een verzameling van technologieën met voldoende gevoeligheid voor het meten van metabolieten in afzonderlijke cellen (Zie beoordelingen ^{4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15}). Reproduceerbaar bemonstering van cellen en efficiënte winning van metabolieten zijn essentieel voor de succesvolle opsporing van metabolieten in afzonderlijke cellen. Geheel-cel dissectie van geïdentificeerde cellen uit Xenopus embryo’s heeft de karakterisatie van kleine moleculen en peptiden¹⁶ingeschakeld. Andere benaderingen hanteren micropipetten om te proeven van de individuele levende cellen gevolgd door detectie met behulp van electrospray ionisatie (ESI) MS. Bijvoorbeeld, de metabolieten in plant of zoogdiercellen werden gemeten door eencellige video MS¹⁷, druk sonde¹⁸, één sonde¹⁹en fluidic kracht microscopie²⁰, onder andere technieken^{21, 22,23,24}. Bovendien vereenvoudigt de opneming van chemische scheiding vóór ionisatie in de eencellige MS workflow efficiënt de metabolome, dus het verlichten van eventuele storingen tijdens ion generatie voor detectie. Bovenal biedt scheiding ook verbinding-specifieke informatie om te helpen in de moleculaire identificaties. Capillaire elektroforese (CE) is gebruikt voor het detecteren van metabolieten in één ontleed^25,26 of microsampled²⁷neuronen, vastleggen van kleine-molecuul verschillen tussen neuron fenotypen. We onlangs aangepast CE aan ESI tandem MS het traceringsniveau detectie van honderden metabolieten in afzonderlijke cellen die werden ontleed van vroege embryo’s van Xenopus laevis^16,28inschakelen. Deze studies bleek verrassend metabole verschillen tussen embryocellen in een vroeg stadium van ontwikkeling en leidde tot de ontdekking van metabolieten met eerder onbekende developmental effecten¹⁶.

Wij bieden hier een protocol dat de detectie van metabolieten in afzonderlijke cellen rechtstreeks in een levende gewervelde embryo met behulp van microprobe eencellige CE-ESI-MS^29,30ingeschakeld. De model-organisme gekozen is de 8-tot-32-cel X. laevis embryo, hoewel de aanpak ook voor de latere stadia van ontwikkeling en andere soorten modelorganismen geldt. Dit protocol maakt gebruik van aangescherpte haarvaten met multi-as vertalende controle onder begeleiding door een high-resolution imaging systeem naar een ~ 10 nL gedeelte van geïdentificeerde cellen in situ in het morfologisch complexe zich ontwikkelende embryo gecombineerd. Deze microprobe is schaalbaar naar kleinere cellen en opereert binnen seconden, dat is voldoende snel om bij te houden van de cel geslachten in het embryo. Na uitpakken polar of apolaire kleine molecules, zoals metabolieten en peptides, uit de verzamelde monster in ~ 4-5 µL extractievloeistof, een ~ 10 nL van de resulterende uittreksel wordt geanalyseerd in een op maat gemaakte CE-platform naar een massaspectrometer ESI afgebroken. Bouw en de exploitatie van het CE-ESI-multiple sclerose platform is gebaseerd op protocollen elders beschreven. ^{31 , 32} de co-axiale CE-ESI-interface wordt geconstrueerd zoals elders beschreven. ³¹ dit platform wordt onderhouden in het regime kegel-jet sproeien om het traceringsniveau gevoeligheid met een capaciteit voor kwantificering over een 4-5 log-volgorde dynamisch bereik (relatieve^28,29,30 of absolute¹⁶). Het CE-ESI-MS platform biedt een 60-amol ondergrens voor detectie met 8% relatieve standaardafwijking (RSD) in kwantificatie over een geteste bereik van 10 nM tot 1 µM voor kleine molecules¹⁶, die toereikend zijn om te karakteriseren van endogene metabolieten in X. laevis cellen. Microprobed cellen blijven verdelen gaandeweg de embryo via ontwikkeling³⁰, waardoor stoffelijk als ruimtelijk opgelost analyse van cellulaire metabolisme. Inderdaad, eencellige CE-ESI-MS kan worden gebruikt voor het vinden van metabole verschillen tussen cellen die de dorsal-ventrale^16,29, dier-plantaardige¹⁶, links-rechts²⁸ developmental assen alsmede cellen in beslag nemen die vormen het zenuwweefsel gedoemd dorsale afstamming van een gemeenschappelijk progenitor cel in X. laevis³⁰. Naast het opvragen van metabole verschillen tussen afzonderlijke embryonale cellen op verschillende ontwikkelingsstadia van de X. laevis embryo³⁰, wij verwachten dat de protocollen die hier worden beschreven zijn van toepassing op een breed scala van biomoleculen en de microsampled van de afzonderlijke cellen uit verschillende stadia van embryonale ontwikkeling, alsmede andere soorten cellen en modelorganismen. Bovendien, kan de microprobe worden gebruikt voor microsampling, terwijl een ander platform compatibel met minuscule monsters kan worden gebruikt voor scheiding en/of karakterisering van biomoleculen.