Microsonde électrophorèse capillaire spectrométrie de masse pour la métabolomique unicellulaires dans les embryons de grenouilles vivent (Xenopus laevis)

Une compréhension approfondie du développement embryonnaire nécessite la caractérisation de tous les changements moléculaires qui se déroulent dans chaque cellule de l’organisme en développement. Tandis que Next-Generation Sequencing avec amplification moléculaire permet de mesure profonde des unicellulaires transcriptomes¹ en développement systèmes^2,3, beaucoup moins on connaît la suite de molécules plus petites produite dans les cellules embryonnaires unique, y compris les protéines et, surtout, de métabolites (masse moléculaire < ~ 1 500 Da). Avec une réponse rapide et dynamique aux événements intrinsèques et extrinsèques, le métabolome est un puissant descripteur d’État moléculaire de la cellule. Le métabolome unicellulaires, soulève donc la possibilité de suivre le développement spatial et temporel de l’hétérogénéité des cellules dans l’embryon précoce et d’identifier de nouvelles molécules pour les études fonctionnelles. Cependant, sans amplification moléculaire disponible pour ces molécules, détection du métabolome exige une sensibilité exceptionnelle à l’aide de la spectrométrie de masse (MS), qui est la technologie de choix pour l’analyse des métabolites.

Unicellulaire MS est une collection de technologies avec une sensibilité suffisante pour mesurer les métabolites dans des cellules individuelles (voir commentaires ^{4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15}). Échantillonnage reproductible des cellules et l’extraction efficace des métabolites sont essentiels à la réussite détection des métabolites dans des cellules individuelles. Dissection de la cellule entière de cellules identifiées d’embryons de Xenopus a permis la caractérisation des petites molécules et de peptides¹⁶. Autres approches emploient micropipettes pour échantillonner des cellules vivantes individuelles suivies de détection par ionisation par électrospray (ESI) MS. Par exemple, métabolites ont été mesurés en usine ou des cellules de mammifères par cellule unique vidéo MS¹⁷, sonde de pression¹⁸, seule sonde¹⁹et microscopie force fluidique²⁰, parmi d’autres techniques^{21, 22,23,24}. En outre, l’incorporation de séparation chimique avant d’ionisation dans le flux de travail MS unicellulaires simplifie efficacement le métabolome, atténuant ainsi les interférences potentielles pendant la génération d’ions avant la détection. Ce qui est important, séparation renseigne également composé spécifique afin d’aider à l’identification moléculaire. Électrophorèse capillaire (EC) a été utilisé pour détecter des métabolites dans unique disséqués^25,26 microsampled²⁷nerveuses, capture de petites molécules différences entre les phénotypes de neurone. Récemment, nous avons adapté CE au tandem ESI MS pour permettre la détection de niveau de trace de centaines de métabolites dans des cellules individuelles qui ont été disséqués de jeunes embryons de Xenopus laevis^16,28. Ces études ont révélé des différences métaboliques surprenants entre les cellules à un stade précoce du développement embryonnaires et conduit à la découverte de métabolites avec précédemment inconnue des impacts du développement¹⁶.

Ici, nous fournissons un protocole permettant la détection des métabolites dans des cellules individuelles directement dans un embryon de vertébrés vivant à l’aide de la microsonde unicellulaires CE-ESI-MS^29,30. L’organisme modèle choisi est la 8 à 32-cellule embryonnaire de X. laevis , bien que l’approche est également applicable aux derniers stades de développement et d’autres types d’organismes modèles. Ce protocole utilise capillaires affûtées multi-axes contrôle traductionnel sous direction par un système d’imagerie à haute résolution d’aspirer une partie de nL ~ 10 de cellules identifiées in situ dans l’embryon en développement morphologiquement complexe. Cette microsonde est évolutif à petites cellules et fonctionne dans les secondes, ce qui est suffisamment rapide pour suivre les lignées cellulaires chez l’embryon. Après extraction de polar ou de petites molécules apolaires, tels que les métabolites et de peptides, de l’échantillon prélevé en environ 4-5 µL de solution d’extraction, un 10 ~ nL de l’extrait obtenu est analysé dans une plate-forme de CE fait sur mesure, couplée à un spectromètre de masse ESI. Construction et l’exploitation de la plate-forme de CE-ESI-MS s’appuie sur les protocoles décrits ailleurs. ^{31 , 32} l’interface CE-ESI coaxiale est construit comme décrit ailleurs. ³¹ cette plate-forme est maintenue dans le régime de pulvérisation de cône-jet pour atteindre trace-niveau sensibilité avec une capacité pour la quantification sur une plage de dynamique de journal-ordre de 4-5 (relative^28,29,30 ou absolue¹⁶). La plateforme de CE-ESI-MS offre 60-amol limite inférieure de détection avec 8 % écart-type relatif (RSD) en analyse quantitative sur une gamme éprouvée de 10 nM à 1 µM pour les petites molécules¹⁶, qui suffisent à caractériser les métabolites endogènes dans X. laevis cellules. Microprobed cellules continuent à se diviser au fur et l’embryon par le biais de développement³⁰, permettant une analyse temporellement et spatialement résolue du métabolisme cellulaire. En effet, seule cellule CE-ESI-MS peut être utilisé pour trouver les différences métaboliques entre les cellules qui occupent la dorsale-ventral^16,29, animal-végétal¹⁶et gauche-droite²⁸ axes du développement ainsi que les cellules qui forment la lignée dorsale vouée de tissu nerveux d’une cellule d’ancêtre commun dans X. laevis³⁰. Outre l’interrogation des différences métaboliques entre différentes cellules embryonnaires à différents stades de développement de l’ embryon de X. laevis ³⁰, nous prévoyons que les protocoles décrits ici soient appliquent à un large éventail de biomolécules et microsampled de cellules individuelles des différents stades du développement embryonnaire, mais aussi des autres types de cellules et des organismes modèles. En outre, la microsonde pourrait servir pour Microprélèvement alors qu’une autre plateforme compatible avec minuscules échantillons pourrait être utilisée pour la séparation et/ou la caractérisation des biomolécules.