JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

Microprobe נימי אלקטרופורזה ספקטרומטריית עבור מטבולומיקס תא בודד ב- Live צפרדע (צפרדע רפואית זריזה) העוברים

Published: December 22, 2017
doi:
10.3791/56956
, , ,
1Department of Chemistry,George Washington University, 2Department of Anatomy & Regenerative Biology,George Washington University, 3Department of Chemistry & Biochemistry,University of Maryland, College Park

Summary

אנו מתארים צעדים המאפשרים דיגום מהיר בתוך באתרו של חלק קטן של תא יחיד עם דיוק גבוהה, הפלישה מינימלי באמצעות נימי מיקרו-דגימה, כדי להקל על אפיון כימי של תמונת מצב של פעילות מטבולית חיים העוברים באמצעות אלקטרופורזה נימי תא בודד לפי הזמנה ספקטרומטר מסה פלטפורמה.

Abstract

כימות של מולקולות קטנות של תאים בודדים מעלה סיכויי החדשה טובה יותר להבנת התהליכים basic העומדים בבסיס התפתחות. אפשר תא בודד לחקירות העוברים ישירות ב בשידור חי, גישות אנליטיות חדשות נדרשים, במיוחד אלה הן רגישות סלקטיבית, כמותיים, חזקים, מדרגי הגדלים תא שונים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר הניתוח ב באתרו של חילוף החומרים בתאים בודדים בפיתוח בחופשיות העוברים על הצפרדע שנחטף ייזרק דרום אפריקאי (זריזה צפרדע רפואית), במודל רב עוצמה התא וביולוגיה התפתחותית. גישה זו משתמשת microprobe נימי לרוקן חלק מוגדר מתאי מזוהה יחיד בתוך העובר, עוזב את התאים הסמוכים שלם לניתוח עוקבות. תוכן שנאספו ניתוח מאת microscale אלקטרופורזה נימי ספקטרומטריית electrospray יינון (CE-ESI) ממשק מצמידים בספקטרומטר טנדם ברזולוציה גבוהה. גישה זו היא להרחבה כדי במגוון גדלים תא ותואמת מבנה תלת-ממדי מורכב של העובר המתפתח. לדוגמה, נדגים את microprobe שתא בודד CE-ESI-MS מאפשרת הבהרה של הטרוגניות תא מטבולית זה מתגלה תאים ובתאים מעורר צאצאים במהלך התפתחות העובר. מלבד התא, ביולוגיה התפתחותית, הפרוטוקולים ניתוח מתא בודד המתוארים כאן נתונות אחרים הגדלים תא, סוגי תאים או בבעלי חיים.

Introduction

הבנה מקיפה של התפתחות דורש אפיון של כל השינויים המולקולריים להתגלות בכל תא של האורגניזם המתפתח. בעוד הדור הבא רצף עם הגברה מולקולרית מאפשרת מדידה עמוק של תא בודד transcriptomes1 פיתוח מערכות2,3, הרבה פחות ידוע על הסוויטה של מולקולות קטנות מיוצר ע י תאים עובריים בודדים, כולל חלבונים, במיוחד, מטבוליטים (מסה מולקולרית < Da ~ 1500). עם תגובה מהירה ודינמית לאירועים פנימי, חיצוני, משמש metabolome מתאר רבי עוצמה של המדינה מולקולרית של התא. Metabolome תא בודד, ולכן מעלה את הפוטנציאל כדי לעקוב אחר התפתחות יכולות תא הטרוגניות של העובר מוקדם וכדי לזהות מולקולות חדשות ללימודי פונקציונלי. עם זאת, ללא זמין עבור מולקולות אלה מולקולרית הגברה, זיהוי של metabolome דורשת רגישות יוצאת דופן באמצעות ספקטרומטר מסה (MS), אשר היא הטכנולוגיה של בחירה עבור ניתוח מטבוליט.

תא בודד MS הוא אוסף של טכנולוגיות עם רגישות מספיק למדוד מטבוליטים של תאים בודדים (ראה הדעת 4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15). לשחזור דגימה של תאים, חילוץ יעיל מטבוליטים חיוניים גילוי מוצלחת של מטבוליטים של תאים בודדים. כל תא דיסקציה של מזוהה תאים מעוברים צפרדע רפואית איפשר האפיון של מולקולות קטנות, פפטידים16. גישות אחרות להעסיק micropipettes לטעום תאים חיים בודדים ואחריו זיהוי באמצעות ספקטרומטריית electrospray יינון (ESI) MS. לדוגמה, מטבוליטים נמדדו צמח או תאים בתרבית של תא בודד וידאו MS17, הלחץ בדיקה18, בדיקה אחת19ועל כוח fluidic מיקרוסקופ20, בין שאר טכניקות21, 22,23,24. בנוסף, התאגדות של הפרדה כימית לפני יינון לתוך תא בודד MS זרימת העבודה ביעילות מפשט את metabolome, וכך להפחית הפרעות אפשריות במהלך יון דור לפני זיהוי. חשוב, ההפרדה מספק גם מידע ספציפי המתחם כדי לסייע בהמשך המולקולרי ופיזיקליים. צינור קפילר אלקטרופורזה (CE) שימש לזהות מטבוליטים ביתור בודד25,microsampled וא26 27הנוירונים, לכידת מולקולה קטנה הבדלים בין תא עצב פנוטיפים. אנחנו לאחרונה המותאמים CE ESI טנדם MS כדי לאפשר זיהוי עקבות ברמת מאות מטבוליטים בתאים בודדים היו גזור מן העוברים מוקדם של צפרדע רפואית זריזה16,28. מחקרים אלה חשפו הבדלים מטבוליים מפתיע בין תאים עובריים בשלב מוקדם של התפתחות והוביל לגילוי של מטבוליטים בעבר לא ידוע השפעות התפתחותיות16.

כאן אנו מספקים פרוטוקול איפשרה הגילוי של מטבוליטים של תאים בודדים ישירות ב- העובר חוליות בשידור חי באמצעות microprobe תא בודד CE-ESI-MS29,30. האורגניזם דגם שבחרת הוא 8-ל-32-התא עובר X. laevis , למרות הגישה חל גם בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות וסוגים אחרים של אורגניזמים מודל. פרוטוקול זה משתמש נימים מחודדים עם שליטה translational ורב ציר תחת הדרכתו על-ידי מערכת הדמיה ברזולוציה גבוהה מחוק לגמרי ~ 10 nL חלק מזוהה תאים ב באתרו של העובר המתפתח מורפולוגית מורכבים. Microprobe זו היא מדרגית לתאים קטנים יותר ופועל תוך שניות, וזה מספיק מהר כדי לעקוב אחר שושלות תאים של העובר. לאחר חילוץ קוטבי או מולקולות קטנות apolar, כגון מטבוליטים, פפטידים, מדגם שנאספו ב ~ 4-5 µL חילוץ הפתרון, 10 ~ nL של התמצית המתקבלת ניתוח ב פלטפורמה CE לפי הזמנה במקף כדי ספקטרומטר מסה ESI. הקמה ותפעול של פלטפורמת CE-ESI-MS בונה על פרוטוקולים אחרים. 31 , 32 הממשק CE-ESI co-צירית נבנה כמתואר. 31 פלטפורמה זו נשמרת המשטר הריסוס קונוס-jet להשיג מעקב ברמת רגישות עם יכולת על כימות מעל 4-5 יומן-הזמנה טווח דינמי (יחסית28,29,30 או מוחלטת16). פלטפורמת CE-ESI-MS מציע מגבלה נמוכה יותר 60-ניסים מונטקיו של זיהוי עם סטיית תקן יחסית (RSD) 8% בכימות על מגוון שנבדקו 10 nM 1 מיקרומטר עבור מולקולות קטנות16, אשר מספיקים לאפיין אנדוגני מטבוליטים ב X. זריזה תאים. Microprobed התאים ממשיכים לחלק ככל מתקדם העובר דרך פיתוח30, מתן אפשרות לניתוח נפתרה חנותם והמרגשים של חילוף החומרים הסלולר. אכן, תא בודד CE-ESI-MS יכול לשמש כדי למצוא הבדלים מטבוליים בין התאים לכבוש את הגבי הגחוני /16,29, בעלי חיים-צמחי16, צירים התפתחותית משמאל28 וכן תאים זה טופס השושלת נגזר רקמה עצבית הגבי מתא קדמון משותף X. laevis30. מלבד הפעלת שאילתות מטבולית ההבדלים בין תאים עובריים בודדים בשלבים התפתחותיים שונים של העובר X. laevis 30, אנו צופים כי הפרוטוקולים המתוארים כאן הם חלים על מגוון רחב של מולקולות, microsampled תאים בודדים של שלבים שונים של התפתחות, כמו גם סוגים אחרים של תאים ואורגניזמים מודל. בנוסף, microprobe יכול לשמש microsampling בזמן פלטפורמה שונה תואם עם דגימות זעיר יכול לשמש עבור הפרדה ו/או אפיון של מולקולות.

Protocol

כל הפרוטוקולים הקשורים התחזוקה, טיפול של צפרדע רפואית זריזה אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה באוניברסיטה. ג’ורג ‘ וושינגטון (IACUC אין. A311). 1. הכנת דגימה מכשירים, מדיה, ממיסים, המנות להכין 1 x הפתרון של שטיינברג (הה) על ידי המסת המלחים הבאים במים הנד?…

Representative Results

אנחנו לאחרונה המועסקים תא בודד microprobe CE-ESI-MS כדי לאפיין מטבוליטים בתאים מזוהה בודדים בפיתוח בחופשיות צפרדע רפואית זריזה עוברי29,30. Microprobe מאפשר מהר (שניה ~ 5/נייד), השאיפה בחיי עיר של ~ 10 nL של תא בודד, השאיפות מרובים באותו התא, או מספר תא?…

Discussion

Microprobe CE-ESI-MS מאפשרת אפיון ישיר מטבוליטים של תאים בודדים בפיתוח חי, בחופשיות עוברי. בלב ליבה של הגישה הם שני רכיבי משנה טכני, כלומר בחיי עיר נימי microsampling ו רגישות גבוהה CE-ESI-גב’ לעומת תאים כל ניתוח, נימי microsampling יש את היתרון של פעולה מהירה (כמה שניות לעומת 5 דקות / תא על-ידי ניתוח), תאימות עם המ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מוסדות של בריאות מענקים GM114854 (כדי P.N.) ו CA211635 (כדי P.N.), ארנולד, מייבל בקמן קרן בקמן יאנג החוקר להעניק (P.N.), בפרס פרופסור צעיר דופונט (כדי P.N.), האגודה האמריקנית למיסה ספקטרומטר מחקר פרס (P.N.), מלגות קרן המועדון קוסמוס (כדי R.M.O. ו- E.P.P.). הדעות והמסקנות לידי ביטוי בפרסום זה הן אך ורק לאלה של המחברים, אינם מייצגים בהכרח התצוגות הרשמי של מקורות מימון.

Materials

Reagents for Embryo Culture Media
Potasium chloride Fisher Scientific BP 366-1
Magnesium sulfate Fisher Scientific M 65-3
Calcium nitrate Sigma Aldrich C1396
Cysteine MP Biomedicals 101444
Trizma hydrochloride Sigma Aldrich T3253
Trizma base Sigma Aldrich T1503
Sodium chloride Fisher Scientific 5641-212
Name Company Catalog Number Comments
Metabolite Extraction Solvents
Acetonitrile (LC-MS-grade) Fisher Scientific A955
Methanol (LC-MS-grade) Fisher Scientific A456
Water (LC-MS-grade) Fisher Scientific W6
Name Company Catalog Number Comments
Solvents and Standards for CE-ESI-MS
Formic acid (LC-MS-grade) Fisher Scientific A11710X1-AMP
Methanol (LC-MS-grade) Fisher Scientific A456-4
Water (LC-MS-grade) Fisher Scientific W6
Sodium chloride Fisher Scientific 5641-212
Acetylcholine chloride Acros Organics 159170050
Name Company Catalog Number Comments
Microprobe Fabrication Setup
Micropippette puller Sutter Instrument Co. P-1000
Borosilicate capillaries Sutter Instrument Co. B100-50-10
Fine sharp forceps: Dumont #5, Biologie/Dumoxel Fine Science Tools (USA) Inc 11252-30 Corrosion resitant and autoclavable.
Name Company Catalog Number Comments
Microprobe Sampling Setup
Micromanipulator Eppendorf, Hauppauge, NY TransferMan 4r
Stereomicroscope Nikon SMZ18 Should be vibrationally isolated.
Illuminator e.g. Goosenecks Nikon C-FLED2
Microinjector Warner Instrument, Handem, CT PLI-100A
Transfer pipettes (Plastic, disposable) Fisher Scientific 13-711-7M
Petri dish 60 mm and 80 mm Fisher Scientific S08184
Glass Pasteur Pipets ( Borosilicate, disposable) Fisher Scientific 13-678-20A
Centrifuge Thermo Scientific Sorvall Legend X1R
Name Company Catalog Number Comments
CE-ESI-MS Setup
High voltage power supply Spellman CZE1000R The HVPS may be controlled remotely using a low-voltage program generated by a personal computer. Caution: High voltage presents electrical shock hazard; all connective parts must be grounded or carefully shielded to prevent users from accidental exposure.
Syringe pumps (2) Harvard Apparatus 704506
Stereomicroscope Amscope SM-3BZZ Stereomicroscope capable of 4.5× magnification, equipped with an illuminator to monitor the spraying mode of the CE-ESI interface.
XYZ translation stage Thorlabs PT3
XYZ translation stage Custom-built This platform is capable of loading nanoliter-amounts of sample into the separation capillary via hydrodynamic injection and supplying the BGE for CE. Both interfaces described in this work were able to inject 6–10 nL of sample within 1 min into a 1 m separation capillary
Stainless steel sample vials Custom-built
Stainless steel BGE vial Custom-built
Fused silica capillary (40 µm/105 µm ID/OD; 100 cm) Polymicro technologies TSP040105
Fused silica capillary (75 µm/360 µm ID/OD; 100 cm) Polymicro technologies TSP075375
Stainless steel emitter with blunt tips (130/260 µm ID/OD) Hamilton Co. 21031A For better performance, laser-cleave and fine-polish the emitter tip.
Syringes (gas-tight): 500 – 1000 µL Hamilton Co. 1750TTL
Digital multimeter Fluke Fluke 117
High-resolution Mass Spectrometer Bruker Daltonics Maxis Impact HD High-resolution tandem mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure interface configured for ESI
Tunning mixture for mass spectrometer calibration Agilent technologies ESI-L G1969-85000
Data Analysis ver. 4.3 software Bruker Daltonics
Name Company Catalog Number Comments
Ancillary Equipment
Vacuum concentrator capable of operation at 4–10°C Labconco 7310022
Analytical microbalance (XSE105DU) Fisher Scientific 01911005
Freezer (-20 °C) Fisher Scientific 97-926-1
Freezer (-80 °C) Fisher Scientific 88300ASP
Refrigerated Incubator Fisher Scientific 11475126
Vortex-mixer Benchmark BS-VM-1000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tang, F. C., Lao, K. Q., Surani, M. A. Development and applications of single-cell transcriptome analysis. Nat. Methods. 8 (4), S6-S11 (2011).
  2. Veselovska, L., et al. Deep sequencing and de novo assembly of the mouse oocyte transcriptome define the contribution of transcription to the DNA methylation landscape. Genome Biol. 16 (209), (2015).
  3. Tran, D. A., Bai, A. Y., Singh, P., Wu, X. W., Szabo, P. E. Characterization of the imprinting signature of mouse embryo fibroblasts by RNA deep sequencing. Nucleic Acids Res. 42 (3), 1772-1783 (2014).
  4. Wang, D. J., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in ‘omics’. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
  5. Svatos, A. Single-cell metabolomics comes of age: new developments in mass spectrometry profiling and imaging. Anal. Chem. 83 (13), 5037-5044 (2011).
  6. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nat. Methods. 8 (4), S20-S29 (2011).
  7. Bodenmiller, B., et al. Multiplexed mass cytometry profiling of cellular states perturbed by small-molecule regulators. Nat. Biotechnol. 30 (9), 858-889 (2012).
  8. Rubakhin, S. S., Lanni, E. J., Sweedler, J. V. Progress toward single cell metabolomics. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (1), 95-104 (2013).
  9. Kleparnik, K., Foret, F. Recent advances in the development of single cell analysis: A review. Anal. Chim. Acta. 800, 12-21 (2013).
  10. Zenobi, R. Single-cell metabolomics: Analytical and biological perspectives. Science. 342 (6163), 1243259 (2013).
  11. Gholipour, Y., Erra-Balsells, R., Nonami, H. In situ pressure probe sampling and UV-MALDI MS for profiling metabolites in living single cells. Mass Spectrom (Tokyo). 1 (1), A0003 (2012).
  12. Comi, T. J., Do, T. D., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Categorizing cells on the basis of their chemical profiles: progress in single-cell mass spectrometry. J. Am. Chem. Soc. 139 (11), 3920-3929 (2017).
  13. Lombard-Banek, C., Portero, E. P., Onjiko, R. M., Nemes, P. New-generation mass spectrometry expands the toolbox of cell and developmental biology. Genesis. 55, e23012 (2017).
  14. Yang, Y. Y., et al. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. Trac-Trends Anal. Chem. 90, 14-26 (2017).
  15. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
  16. Onjiko, R. M., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry reveals small molecules that affect cell fates in the 16-cell embryo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (21), 6545-6550 (2015).
  17. Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. J. Mass Spectrom. 43 (12), 1692-1700 (2008).
  18. Nakashima, T., et al. Single-cell metabolite profiling of stalk and glandular cells of intact trichomes with internal electrode capillary pressure probe electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 88 (6), 3049-3057 (2016).
  19. Pan, N., et al. The single-probe: A miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Anal. Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).
  20. Guillaume-Gentil, O., et al. Single-cell mass spectrometry of metabolites extracted from live cells by fluidic force microscopy. Anal. Chem. 89 (9), 5017-5023 (2017).
  21. Saha-Shah, A., Green, C. M., Abraham, D. H., Baker, L. A. Segmented flow sampling with push-pull theta pipettes. Analyst. 141 (6), 1958-1965 (2016).
  22. Hu, J., et al. Synchronized polarization induced electrospray: Comprehensively profiling biomolecules in single cells by combining both positive-ion and negative-ion mass spectra. Anal. Chem. 88 (14), 7245-7251 (2016).
  23. Zhang, L. W., Vertes, A. Energy charge, redox state, and metabolite turnover in single human hepatocytes revealed by capillary microsampling mass spectrometry. Anal. Chem. 87 (20), 10397-10405 (2015).
  24. Zhang, L. W., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
  25. Lapainis, T., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Capillary electrophoresis with electrospray ionization mass spectrometric detection for single-cell metabolomics. Anal. Chem. 81 (14), 5858-5864 (2009).
  26. Nemes, P., Knolhoff, A. M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Metabolic differentiation of neuronal phenotypes by single-cell capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 83 (17), 6810-6817 (2011).
  27. Aerts, J. T., et al. Patch clamp electrophysiology and capillary electrophoresis mass spectrometry metabolomics for single cell characterization. Anal. Chem. 86 (6), 3203-3208 (2014).
  28. Onjiko, R. M., Morris, S. E., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry with multi-solvent extraction identifies metabolic differences between left and right blastomeres in the 8-cell frog (Xenopus) embryo. Analyst. 141 (12), 3648-3656 (2016).
  29. Onjiko, R. M., Plotnick, D. O., Moody, S. A., Nemes, P. Metabolic comparison of dorsal versus ventral cells directly in the live 8-cell frog embryo by microprobe single-cell CE-ESI-MS. Anal. Methods. , (2017).
  30. Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. In situ microprobe single-cell capillary electrophoresis mass spectrometry: Metabolic reorganization in single differentiating cells in the live vertebrate (Xenopus laevis) embryo. Anal. Chem. 89, 7069-7076 (2017).
  31. Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nat. Protoc. 8 (4), 783-799 (2013).
  32. Knolhoff, A. M., Nemes, P., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V., Wevers, R., Lutz, N., Sweedler, J. V. . Methodologies for Metabolomics. , 119-139 (2013).
  33. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2000).
  34. Moody, S. A. Cell lineage analysis in Xenopus embryos. Methods Mol Biol. 135, 331-347 (2000).
  35. Bowes, J. B., et al. Xenbase: a Xenopus biology and genomics resource. Nucleic Acids Res. 36, D761-D767 (2008).
  36. Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43 (D1), D756-D763 (2015).
  37. James-Zorn, C., et al. Xenbase: expansion and updates of the Xenopus model organism database. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D865-D870 (2013).
  38. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
  39. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
  40. Dale, L., Slack, J. M. W. Fate map for the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 99 (4), 527-551 (1987).
  41. Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Dev. Biol. 120 (1), 299-304 (1987).
  42. Rollman, C. M., Moini, M. Ultrafast capillary electrophoresis/mass spectrometry of controlled substances with optical isomer separation in about a minute. Rapid Commun. Mass Spectrom. 30 (18), 2070-2076 (2016).
  43. Moini, M., Martinez, B. Ultrafast capillary electrophoresis/mass spectrometry with adjustable porous tip for a rapid analysis of protein digest in about a minute. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (3), 305-310 (2014).
  44. Huhn, C., Ramautar, R., Wuhrer, M., Somsen, G. W. Relevance and use of capillary coatings in capillary electrophoresis-mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 396 (1), 297-314 (2010).
  45. Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays. Anal. Chem. 79 (8), 3105-3116 (2007).
  46. Zhu, Z. J., et al. Liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry characterization of metabolites guided by the METLIN database. Nat. Protoc. 8 (3), 451-460 (2013).
  47. Wishart, D. S., et al. HMDB 3.0 The Human Metabolome Database in 2013. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D801-D807 (2013).
  48. Liu, J. X., Aerts, J. T., Rubakhin, S. S., Zhang, X. X., Sweedler, J. V. Analysis of endogenous nucleotides by single cell capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analyst. 139 (22), 5835-5842 (2014).
  49. Hubrecht, L., Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1967).
  50. Grant, P. A., Herold, M. B., Moody, S. A. Blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development. J. Vis. Exp. (71), (2013).
  51. Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nat. Protoc. 6 (8), 1241-1249 (2011).

Tags

MicroprobeCapillary ElectrophoresisMass SpectrometrySingle-cell MetabolomicsLive FrogXenopus LaevisEmbryosIn Situ MicrosamplingCell BiologyDevelopmental BiologyMinimally Invasive SamplingAgarose GelPasteur PipetteBorosilicate CapillariesFlaming/Brown Type Capillary PullerDejellyingSteinberg’s SolutionGonadotropinIn Vitro Fertilization

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos. J. Vis. Exp. (130), e56956, doi:10.3791/56956 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image