Summary

Handy-Aggregation-Assays, die Bindung der Drosophila Kerbe mit Transzu bewerten-Liganden und ihre Hemmung von Cis-Liganden

Published: January 02, 2018
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Summary

Komplexität von in-Vivo -Systemen erschwert die Unterscheidung zwischen Aktivierung und Hemmung des Notch-Rezeptors durch Trans– und Cis-Liganden, beziehungsweise. Hier präsentieren wir ein Protokoll basiert auf in-vitro- Zelle-Aggregation-Assays für die semi-quantitative und qualitative Bewertung der Bindung von Drosophila -Kerbe zu Trans-Liganden Vs GUS-Liganden.

Abstract

Kerbe-Signalisierung ist ein evolutionär konservierte Zell-Zell-Kommunikations-System im großen und ganzen in Tierentwicklung und Erwachsenen Wartung verwendet. Interaktion des Notch-Rezeptors mit Liganden von benachbarten Zellen induziert Aktivierung der Signalweg (Trans-Aktivierung), während der Interaktion mit Liganden aus der gleichen Zelle Signalisierung hemmt (Cis-Hemmung). Richtige Balance zwischen Trans-Aktivierung und Cis-Hemmung hilft optimale Notch signaling in einigen Kontexten während Tierentwicklung festzusetzen. Aufgrund der überlappenden Ausdruck Domänen der Kerbe und seine Liganden in vielen Zelltypen und die Existenz der Feedback-Mechanismen, studieren die Auswirkungen einer bestimmten Post-translationale Modifikation auf Trans– im Vergleich zu Cis-Interaktionen der Kerbe und die Liganden in Vivo ist schwierig. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Verwendung von Drosophila S2 Zellen in Zelle Aggregation Tests zur Beurteilung der Auswirkungen der eine Kerbe Weg Modifikator auf die Bindung von Kerbe an jeder Ligand in Trans und in GUSumzuwerfen. S2-Zellen stabil oder vorübergehend mit einer Kerbe exprimierenden Vektor transfiziert werden mit Zellen, die mit dem Ausdruck jeder Notch-Liganden (S2-Delta oder S2 gesägt) gemischt. Trans-Bindung zwischen Rezeptor und Liganden führt zur Bildung der heterotypen Zelle Aggregate und ist gemessen an der Anzahl der Aggregate pro mL bestehend aus > 6 Zellen. Zu prüfen, die hemmende Wirkung von Cis-Liganden, S2-Zellen Co Ausdruck Kerbe und jede Liganden sind gemischt mit S2-Delta oder S2 gesägt Zellen und die Anzahl der Aggregate wird quantifiziert, wie oben beschrieben. Der relative Rückgang in der Anzahl der Aggregate durch die Anwesenheit von Cis-Liganden liefert ein Maß für GUS-Liganden-vermittelte Hemmung der Trans-Bindung. Diese einfache Assays können semi-quantitative Angaben über die Auswirkungen der genetischen oder pharmakologische Manipulationen auf die Bindung der Kerbe an seinen Liganden und können helfen, die molekularen Mechanismen der in Vivo -Effekte der Entschlüsselung solche Manipulationen auf Kerbe zu signalisieren.

Introduction

Kanonische Kerbe Signalisierung ist ein Nahbereichskommunikation von Zelle zu Zelle-Mechanismus, der Körperkontakt der benachbarten Zellen, um die Interaktion zwischen Notch Rezeptoren und ihre Liganden1erfordert. Interaktion des Notch-Rezeptors (vorhanden auf der Oberfläche der Signal-Empfang Zellen) mit Liganden (auf der Oberfläche des Signal senden Zellen) initiiert, Kerbe Signalisierung und ist bekannt als Trans-Aktivierung2. Auf der anderen Seite Interaktion zwischen Kerbe und seine Liganden in derselben Zelle führt zur Hemmung der Notch-Signalweg und ist bekannt als Cis-Hemmung3. Die Balance zwischen Trans– und Cis-Interaktionen ist erforderlich, um optimale Liganden-abhängige Kerbe4Signalisierung zu gewährleisten. Drosophila ist ein Notch-Rezeptor und zwei Liganden (Delta und Serrate) im Gegensatz zu Säugetieren, die vier Notch Rezeptoren und fünf Liganden haben [gezackt 1 (JAG1), JAG2, Delta-Like 1 (DLL1), DLL3 und DLL4]5. Diese Einfachheit bietet, der Drosophila -Modell die Leichtigkeit zu sezieren/Studie die Auswirkungen der Weg-Modifikatoren auf Notch-Liganden Interaktionen und anschließend auf Kerbe Signalisierung. In bestimmten Kontexten während der tierischen Entwicklung (einschließlich Flügel Entwicklung in Drosophila), Cis– und Trans-Interaktionen zu erreichen, richtige Kerbe Signalisierung und Schicksal1,6 Zelle beteiligt sind . Es ist wichtig zu unterscheiden, die Beeinflussung der Kerbe Weg Modifikatoren in diesen Kontexten Cis– und Trans-Interaktionen der Kerbe mit seinen Liganden.

Unsere Fraktion berichtete zuvor, dass Zusatz von ein Kohlenhydrat-Rückstand genannt Xylose, Drosophila Kerbe negativ Notch signaling in bestimmten Kontexten reguliert, einschließlich Flügel Entwicklung7. Verlust der Shams (das Enzym, dass Xylosylates Kerbe) führt zu einem “Verlust der Flügel Vene” Phänotyp7. In jüngerer Zeit, dienten die gen Dosierung Experimente und klonale Analyse zeigen, dass Verlust der Shams Delta-vermittelten Kerbe Vereinzelung verbessert. Zu unterscheiden, ob die verbesserte Kerbe Signalisierung in Shams Mutanten eine Folge der verminderten Cis ist-Hemmung oder erhöhten Trans-Aktivierung, ektopische Überexpression Studien von Notch-Liganden in Larven Flügel imaginalen Scheiben mit dem Dpp-GAL4 -Treiber wurden durchgeführt. Diese Experimente zur Verfügung gestellt, Anhaltspunkte dafür, dass Shams regelt Trans-Aktivierung des Notch von Delta ohne Kerbe Cis-Hemmung durch Liganden8. Jedoch Feed-Back-Regeln und Auswirkungen der endogenen Liganden möglicherweise erschweren die Interpretation von ektopische Überexpression Studien1,6,9.

Beheben Sie dieses Problem, Drosophila S2 Zellen10 wurden verwendet, die einen einfachen in Vitro -System für Notch-Liganden Interaktion Studien11,12vorsehen. S2-Zellen nicht endogene Notch-Rezeptor und Delta Ligand11 ausdrücken und Ausdrücken ein niedriges Niveau der gesägt13, der Notch-Liganden Aggregation Experimente8nicht beeinflusst. Daher können S2 Zellen stabil oder vorübergehend transfiziert werden durch Kerbe und/oder einzelne Liganden (Delta oder Serrate), um Zellen zu generieren, die ausschließlich den Notch-Rezeptor oder eines ihrer Liganden ausdrücken oder eine Kombination davon. Mischen von S2 Kerbe exprimierenden Zellen mit Liganden exprimierenden S2 Zellen führt zur Bildung von heterotypen Aggregate vermittelt durch Rezeptor-Ligand verbindliche11,12,14. Quantifizierung der Aggregatbildung liefert ein Maß für Trans-Bindung zwischen Kerbe und seine Liganden15 (Abbildung 1). In ähnlicher Weise können S2 Zellen Co transfected mit Notch und Delta oder Serrate Liganden werden (d.h. Cis-Liganden). CIS-Liganden in diese Kerbe exprimierenden S2-Zellen aufheben die Bindung der Kerbe mit Trans-Liganden und führt zu verringerte Aggregatbildung8,12,14. Der relative Rückgang der Aggregatbildung verursacht durch GUS-Liganden liefert ein Maß für die hemmende Wirkung von Cis-Liganden auf die Bindung zwischen Kerbe und Trans-Liganden (Abbildung 2). Dementsprechend Zelle Aggregation Assays wurden genutzt, um untersuchen die Auswirkungen des Verlustes von Xylosylation auf Trans– und Cis-Wechselwirkungen zwischen Kerbe und seine Liganden.

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für Zelle Aggregation Assays zielte darauf ab, die Bindung der Kerbe mit Transbewerten-Liganden und ihre Hemmung von Cis-Liganden mit Drosophila S2 Zellen. Als Beispiel, wir liefern die Daten, die uns erlaubt, die Wirkung der Kerbe Xylosylation auf Bindung zwischen Kerbe und Transbestimmen-Delta8. Diese einfachen Tests eine semi-quantitative Beurteilung der Notch-Liganden Interaktionen in-vitro- und helfen, die molekularen Mechanismen der in Vivo -Effekte der Notch-Signalweg-Modifikatoren zu bestimmen.

Protocol

1. Vorbereitung von Double-Stranded RNA (DsRNA) für Shams Knockdown PCR-Amplifikation der Produkte Verwenden Sie genomischer DNA Wildtyp gelb weiß (w y) und pAc5.1-EGFP als Vorlage und die folgende Primer-Paaren, um die DNA-Fragmente in DsRNA Synthese verwendet zu verstärken. Verwenden Sie die folgenden PCR Temperaturprofil: Denaturierung (95 ° C, 30 s), Glühen (58 ° C, 30 s) und Verlängerung (72 ° C, 1 min). Grünes fluoreszie…

Representative Results

Unsere Beobachtungen in Vivo vorgeschlagen, dass Verlust der Xylosyltransferase gen Shams führt zu Gewinn von Notch Signalisierung durch Delta-vermittelten Transerhöht-Aktivierung des Notch ohne Beeinträchtigung der Cis-Hemmung der Kerbe von Liganden8. Um diese Idee zu testen, wurden in-vitro- Zelle Aggregation Assays durchgeführt. Erstens wurde Shams Ausdruck in S2-Zellen abgerissen mit Shams DsRNA…

Discussion

Kanonische Notch signaling hängt die Wechselwirkungen zwischen den Notch-Rezeptor und seine Liganden-5. Obwohl die meisten Studien auf der Notch-Signalweg in erster Linie die Bindung von Notch und Liganden in benachbarten Zellen (Trans) betrachten, Kerbe und dieselbe Zelle Liganden wirken zusammen, und diese sogenannten GUS-Interaktionen können eine hemmende Rolle in Aussparung 3,4-Signalisierung. Entsprechend, um die M…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren erkennen Unterstützung von NIH/NIGMS (R01GM084135, HJN) und Mizutani Stiftung für Glycoscience (#110071 Finanzhilfe für HJN) und sind dankbar, Tom V. Lee für Diskussionen und Anregungen auf die Assays und Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine und Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) für Plasmide und Zell-Linien.

Materials

BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified Lonza 04-351Q
HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution GE Healthcare lifescience  SV30010
CELLSTAR 6 well plate Greiner Bio-One 657 160
CELLSTAR 24 well plate Greiner Bio-One 662160
VWR mini shaker Marshell Sceintific 12520-956
Hemocytometer Fisher Sceintific  267110
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311
MEGAscrip T7 Transcription Kit Ambion AM1334
Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) Zymo Research R1054
VistaVision Inverted microscope VWR
9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software AmScope MU-900 Image acquisition using ToupView software
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K210012
Fetal Bovine Serum GenDepot F0600-050
Methotrexate Sigma-Aldrich A6770-10
Hygromycin B Invitrogen HY068-L6
Copper sulphate Macron Fine Chemicals 4448-02
S2 cells Invitrogen R69007
S2-SerrateTom cells Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)
S2-Delta cells DGRC 152
S2-Notch cells DGRC 154
pMT-Delta vector DGRC 1021 Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pMT-Serrate vector Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)
pMT-Notch vector DGRC 1022 Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFP Gift from Hugo Bellen
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit Applied Biosystem 1611091
TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) Applied Biosystem Dm02144576_g1  with FAM-MGB dye
TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) Applied Biosystem Dm02151827_g1 with FAM-MGB dye
Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system Applied Biosystem 4351405 96-well Block module

References

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Cite This Article
Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands. J. Vis. Exp. (131), e56919, doi:10.3791/56919 (2018).

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