Cel aggregatie testen om te evalueren van de Binding van de Drosophila inkeping met Trans-liganden en haar remming door Cis-liganden
Summary
Complexiteit van in-vivo systemen maakt het moeilijk om te onderscheiden tussen de activering en de remming van de inkeping receptor door trans– en GOS-liganden, respectievelijk. Hier presenteren we een protocol op basis van in vitro cel-aggregatie testen voor kwalitatieve en semi-kwantitatieve evaluatie van de binding van Drosophila uitsparing aan trans-liganden vs cis-liganden.
Abstract
Inkeping signalering is een evolutionair geconserveerde cel-cel communicatiesysteem gebruikt in grote lijnen in dierlijke ontwikkeling en volwassen onderhoud. Interactie van de inkeping receptor met liganden van naburige cellen induceert activering van de signalering pathway (trans-activering), terwijl de interactie met liganden van dezelfde cel remt signalering (cis-remming). Evenwicht tussen trans-activering en cis-inhibitie helpt optimale gehalte aan Notch signalering in sommige contexten tijdens dierlijke ontwikkeling. Vanwege de overlappende domeinen van de expressie van Inkeping en de liganden in veel celtypen en het bestaan van mechanismen voor feedback, bestudeert de effecten van een bepaalde posttranslationele wijziging op trans– versus cis-interacties van Inkeping en de liganden in vivo is moeilijk. Hier beschrijven we een protocol voor het gebruik van Drosophila S2 cellen in cel-aggregatie testen om te beoordelen van de effecten van neerhalend een inkeping traject modifier op de binding van uitsparing aan elke ligand in trans en cis. S2 cellen stabiel of Transient transfected met een inkeping-uiten vector worden gemengd met cellen uiten van elke inkeping ligand (S2-Delta of S2-Serrate). Trans-binding tussen de receptor en de liganden resulteert in de vorming van heterotypic cel aggregaten en wordt afgemeten aan het aantal aggregaten per mL samengesteld uit > 6 cellen. Om te onderzoeken het remmende effect van cis-liganden, S2 cellen mede uiting van Inkeping en elke ligand worden vermengd met S2-Delta of S2-Serrate cellen en het aantal aggregaten is gekwantificeerd zoals hierboven beschreven. De relatieve daling in het aantal aggregaten als gevolg van de aanwezigheid van cis-liganden biedt een zekere mate van cis-ligand-gemedieerde remming van de trans-bindend. Deze eenvoudige tests kunnen semi-kwantitatieve gegevens over de gevolgen van genetische of farmacologische manipulaties op de binding van uitsparing aan de liganden, en kunnen helpen bij het ontcijferen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de in vivo effecten van dergelijke manipulaties op Notch signalering.
Introduction
Canonieke Notch signalering is een korte afstand van cel naar cel communicatiemechanisme dat fysiek contact van naburige cellen om het faciliteren van de interactie tussen Inkeping receptoren en hun liganden1vereist. Interactie van Inkeping receptor (aanwezig op het oppervlak van signaal-ontvangende cellen) met liganden (aanwezig op het oppervlak van het verzenden van het signaal cellen) initieert Notch signalering en staat bekend als trans-activering2. Aan de andere kant, interactie tussen Inkeping en de liganden in dezelfde cel leidt tot de remming van de inkeping traject en staat bekend als de cis-inhibitie3. Het evenwicht tussen trans– en cis-interacties nodig is om de optimale ligand-afhankelijke Notch signalering van4. Drosophila heeft een inkeping receptor en twee liganden (Delta en Serrate) in tegenstelling tot zoogdieren, die vier Notch receptoren en vijf liganden hebben [1 (JAG1), JAG2, onderdrukking van gekartelde delta-achtige 1 (DLL1), DLL3 en DLL4]5. Deze eenvoud biedt, de Drosophila model het gemak om te ontleden/studie de effecten van pad modifiers over Notch-ligand interacties en vervolgens over de inkeping signalering. In bepaalde contexten tijdens dierlijke ontwikkeling (inclusief vleugel ontwikkeling in Drosophila), zowel cis– en trans-interacties zijn betrokken cell lot1,6 te bereiken goede Notch signalering . Het is belangrijk om te onderscheiden van de gevolgen van Inkeping traject modifiers in de volgende contexten voor cis– en trans-interacties van inkeping met haar liganden.
Onze fractie heeft eerder gerapporteerd dat de toevoeging van een residu van de koolhydraten genaamd xylose aan Drosophila Notch negatief Notch signalering in bepaalde contexten regelt, met inbegrip van vleugel ontwikkeling7. Verlies van shams (het enzym dat xylosylates inkeping) leidt tot een “verlies van vleugel ader” fenotype7. Meer recentelijk, gene dosering experimenten en klonen analyse werden gebruikt om te laten zien dat verlies van shams Delta-gemedieerde Notch geviseerd versterkt. Om te onderscheiden of de verbeterde Notch signalering in shams mutanten een gevolg van de verminderde cis is-inhibitie of toegenomen trans-activering, ectopische overexpressie studies van Inkeping liganden in larvale vleugel imaginaire schijven met het stuurprogramma van de dpp-GAL4 werden uitgevoerd. Deze experimenten geleverd bewijs suggereert dat Shams regelt trans-activering van Inkeping door Delta zonder Notch cis-remming door liganden8. Echter, feed-back verordeningen en effecten van endogene liganden zou compliceren de interpretatie van ectopische overexpressie studies1,6,9.
U lost dit probleem, Drosophila S2 cellen10 werden gebruikt, die voorzien in een systeem eenvoudig in vitro Notch-ligand interactie studies11,12. S2 cellen niet express endogene Notch receptor en Delta ligand11 en een laag niveau van Serrate13, dat heeft geen invloed op de inkeping-ligand aggregatie experimenten8express. Daarom kunnen S2 cellen zijn stabiel of Transient transfected door Inkeping en/of individuele liganden (Delta of Serrate) voor het genereren van cellen die uitsluitend uitdrukking geven aan de receptor inkeping of één van haar liganden, of een combinatie daarvan. Mengen van Inkeping-uiten S2 cellen met ligand-uiten S2 cellen resulteert in de vorming van heterotypic aggregaten gemedieerd door receptor-ligand bindende11,12,14. Kwantificering van de totale vorming biedt een zekere mate van trans-bindend tussen Inkeping en de liganden15 (Figuur 1). Evenzo S2 cellen kunnen mede transfected met inkeping en Delta of Serrate liganden (d.w.z. cis-liganden). CIS-liganden in deze cellen Notch-uiten S2 trekt de binding van inkeping met trans-liganden en resultaat in daalde de totale vorming8,12,14. De relatieve afname van de totale vorming veroorzaakt door cis-liganden biedt een zekere mate van de remmende werking van cis-liganden op binding tussen Inkeping en trans-liganden (Figuur 2). Dienovereenkomstig, cel aggregatie assays werden gebruikt om de onderzoeken van het effect van het verlies van xylosylation op trans– en cis-interacties tussen Inkeping en de liganden.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor cel aggregatie tests gericht op het evalueren van de binding van inkeping met trans-liganden en haar remming door cis-liganden cuvetten van Drosophila S2. Als een voorbeeld, bieden wij de gegevens die ons toegestaan om te bepalen van het effect van de inkeping xylosylation op de binding tussen Inkeping en trans-Delta8. Deze eenvoudige tests bieden een semi-kwantitatieve beoordeling van Inkeping-ligand interacties in vitro en helpen bij het bepalen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de in vivo effecten van Inkeping traject modifiers.
Protocol
Representative Results
Discussion
Canonieke Notch signalering, hangt af van de interacties tussen de inkeping-receptor en de liganden5. Hoewel de meeste studies over de inkeping pathway overwegen voornamelijk de binding van de Inkeping en liganden in naburige cellen (trans), Inkeping en dezelfde-cel liganden werken, en deze zogenaamde GOS-interacties een remmende rol kunnen spelen in de inkeping signalering van3,4. Om te ontcijferen van de mechanismen die…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen steun van de NIH/NIGMS (R01GM084135 tot HJN) en Mizutani Stichting voor Glycoscience (grant #110071 naar HJN), en zijn dankbaar aan Tom V. Lee voor discussies en suggesties op het testen, en Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine en de Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) voor plasmiden en cellijnen.
Materials
| BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified | Lonza | 04-351Q | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare lifescience | SV30010 | |
| CELLSTAR 6 well plate | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| CELLSTAR 24 well plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| VWR mini shaker | Marshell Sceintific | 12520-956 | |
| Hemocytometer | Fisher Sceintific | 267110 | |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| MEGAscrip T7 Transcription Kit | Ambion | AM1334 | |
| Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) | Zymo Research | R1054 | |
| VistaVision Inverted microscope | VWR | ||
| 9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software | AmScope | MU-900 | Image acquisition using ToupView software |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| Fetal Bovine Serum | GenDepot | F0600-050 | |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | HY068-L6 | |
| Copper sulphate | Macron Fine Chemicals | 4448-02 | |
| S2 cells | Invitrogen | R69007 | |
| S2-SerrateTom cells | Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013) | ||
| S2-Delta cells | DGRC | 152 | |
| S2-Notch cells | DGRC | 154 | |
| pMT-Delta vector | DGRC | 1021 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pMT-Serrate vector | Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003) | ||
| pMT-Notch vector | DGRC | 1022 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pAc5.1-EGFP | Gift from Hugo Bellen | ||
| TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit | Applied Biosystem | 1611091 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) | Applied Biosystem | Dm02144576_g1 | with FAM-MGB dye |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) | Applied Biosystem | Dm02151827_g1 | with FAM-MGB dye |
| Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystem | 4351405 | 96-well Block module |
References
- de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).
- Fortini, M. E. Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation. Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).
- del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling. Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).
- Sprinzak, D., et al. Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states. Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).
- Kopan, R., Ilagan, M. X. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
- Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis. Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).
- Lee, T. V., et al. Negative regulation of notch signaling by xylose. PLoS Genet. 9 (6), e1003547 (2013).
- Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila. PLoS Genet. 13 (4), e1006723 (2017).
- Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila. Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).
- Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
- Fleming, R. J., et al. An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling. Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).
- Saj, A., et al. A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network. Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).
- Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila. Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).
- Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling. J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe. J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).
- Acar, M., et al. Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling. Cell. 132 (2), 247-258 (2008).
- Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions. Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).
- Yamamoto, S., et al. A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands. Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).
