Cella di aggregazione saggi per valutare l'associazione della tacca della drosofila con Trans-ligandi e la sua inibizione di Cis-ligandi
Summary
Complessità dei sistemi in vivo rende difficile distinguere tra l’attivazione e l’inibizione del recettore Notch di trans– e cis-ligandi, rispettivamente. Qui, presentiamo un protocollo basato su in vitro saggi l’aggregazione delle cellule per la valutazione qualitativa e semiquantitativa del legame di Drosophila tacca alla trans-ligandi vs cis-ligandi.
Abstract
Tacca di segnalazione è un sistema di comunicazione cellula-cellula evolutivamente conservati utilizzato largamente in sviluppo degli animali e manutenzione dell’adulto. Interazione del recettore Notch con ligandi da cellule vicine induce l’attivazione del pathway di segnalazione (trans-attivazione), mentre l’interazione con ligandi dalla stessa cellula inibisce la segnalazione (cis-inibizione). Giusto equilibrio tra trans-attivazione e cis-inibizione aiuta a stabilire i livelli ottimali di tacca di segnalazione in alcuni contesti durante lo sviluppo degli animali. A causa dei domini di espressione sovrapposti di tacca ed i suoi ligandi in molti tipi cellulari e l’esistenza di meccanismi di feedback, studiando gli effetti di una determinata modifica alberino-translational su trans– versus cis-interazioni della tacca e suoi ligandi in vivo è difficile. Qui, descriviamo un protocollo per l’utilizzo della drosofila S2 cellule nelle analisi di aggregazione cellulare per valutare gli effetti di abbattere un modificatore di pathway di Notch nell’associazione della tacca ogni legante in trans e cis. S2 cellule stabilmente o transitoriamente trasfettate con un vettore che esprimono Notch sono mescolate con le cellule che esprimono ogni ligando Notch (S2-Delta o S2-dentellato). Trans-associazione tra i recettori e ligandi provoca la formazione di aggregati cellulari eterotipiche e viene misurata in termini di numero di aggregati / mL composto > 6 celle. Per esaminare l’effetto inibitorio di cis-ligandi, S2 cellule cheesprimono tacca e ogni ligando sono mescolate con le cellule S2-Delta o S2-dentellato e il numero degli aggregati è quantificato come descritto sopra. La relativa diminuzione del numero degli aggregati per la presenza di cis-ligandi fornisce una misura della cis-ligando-mediato l’inibizione di trans-associazione. Queste analisi semplice sugli effetti delle manipolazioni genetiche o farmacologici sull’associazione della tacca per suoi ligandi in grado di fornire dati semi-quantitativi e possono aiutare a decifrare i meccanismi molecolari sottostanti gli effetti in vivo di tali manipolazioni sulla tacca di segnalazione.
Introduction
Canonico tacca di segnalazione è un meccanismo di comunicazione tra cellule a corto raggio che richiede il contatto fisico delle cellule per facilitare l’interazione tra recettori Notch e loro ligandi1vicine. Interazione del recettore Notch (presente sulla superficie delle cellule di segnale di ricezione) con ligandi (presenti sulla superficie di invio di segnale celle) avvia la tacca di segnalazione ed è conosciuta come trans-attivazione2. D’altra parte, l’interazione tra tacca ed i suoi ligandi nella stessa cella conduce all’inibizione del pathway Notch ed è conosciuta come cis-inibizione3. L’equilibrio tra trans– e cis-interazioni è necessaria per garantire l’ottima tacca di ligando-dipendenti di segnalazione4. Drosophila ha un recettore Notch e due ligandi (Delta e dentellato) al contrario di mammiferi, che hanno quattro tacca recettori e cinque ligandi [jagged 1 (JAG1), JAG2, delta-simile 1 (DLL1), DLL3 e DLL4]5. Avendo questa semplicità, il modello di Drosophila offre la facilità per sezionare/studio gli effetti dei modificatori di percorso su interazioni ligando Notch e successivamente su tacca di segnalazione. In determinati contesti durante lo sviluppo degli animali (tra cui lo sviluppo dell’ala in Drosophila), entrambi cis– e trans-interazioni sono coinvolti per ottenere adeguata tacca di segnalazione e delle cellule a destino1,6 . È importante distinguere gli effetti dei modificatori di pathway di Notch in questi contesti il cis– e trans-interazioni della tacca con suoi ligandi.
Il nostro gruppo ha precedentemente segnalato che l’aggiunta di un residuo di carboidrato chiamato xilosio di Drosophila tacca negativamente regola tacca di segnalazione in determinati contesti, tra cui ala sviluppo7. Perdita di shams (l’enzima che xylosylates tacca) conduce ad un fenotipo di “perdita della vena di ala”7. Più recentemente, gli esperimenti di dosaggio del gene e l’analisi clonale sono stati utilizzati per mostrare che la perdita di shams migliora tacca Delta-mediata individuazione. Distinguere se la tacca di segnalazione avanzata nei mutanti di shams è il risultato di una riduzione cis-inibizione o aumentata trans-attivazione, studi di sovraespressione ectopica di ligandi di Notch in dischi immaginali larvale ala sono state effettuate utilizzando il driver di dpp-GAL4 . Questi esperimenti fornito prova che suggerisce che Shams regola trans-attivazione di tacca da Delta senza intaccare la tacca cis-inibizione di ligandi8. Tuttavia, feed-back regolamenti e gli effetti dei ligandi endogeni potrebbero complicare l’interpretazione di sovraespressione ectopica studi1,6,9.
Per risolvere questo problema, drosofila S2 cellule10 sono stati utilizzati, che fornisce un sistema semplice in vitro per tacca-ligando interazione studi11,12. S2 cellule non esprimono endogeno del recettore Notch e Delta ligando11 ed esprimere un basso livello di dentellato13, che non influisce tacca-ligando aggregazione esperimenti8. Pertanto, le cellule S2 possono essere stabilmente o transitoriamente transfected di Notch e/o singoli ligandi (Delta o dentellato) per generare le cellule che esprimono esclusivamente il recettore Notch o uno dei suoi ligandi o una loro combinazione. Miscelazione delle cellule che esprimono Notch S2 con ligando-esprimendo risultati di cellule S2 nella formazione degli aggregati eterotipiche mediata da recettore-ligando associazione11,12,14. Quantificazione della formazione aggregata fornisce una misura della trans-associazione tra tacca e suoi ligandi15 (Figura 1). Allo stesso modo, le cellule S2 possono essere co-trasfettate con ligandi tacca e Delta o Serrate (cioè cis-ligandi). CIS-ligandi in queste cellule che esprimono Notch S2 abrogare l’associazione della tacca con trans-ligandi e risultato in diminuzione formazione aggregata8,12,14. Il relativo calo in formazione aggregata causata da cis-ligandi fornisce una misura dell’effetto inibitorio di cis-ligandi sull’associazione tra tacca e trans-ligandi (Figura 2). Di conseguenza, le analisi di aggregazione delle cellule sono state utilizzate per esaminare l’effetto di perdita di xylosylation trans– e cis-interazioni tra tacca ed i suoi ligandi.
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per saggi di aggregazione cellulare finalizzata a valutare l’associazione della tacca con trans-ligandi e la sua inibizione di cis-ligandi usando le cellule della drosofila S2. Ad esempio, forniamo i dati che ci ha permesso di determinare l’effetto di xylosylation tacca sull’associazione tra tacca e trans-Delta8. Queste analisi semplice forniscono una valutazione semi-quantitativa del tacca-ligando interazioni in vitro e consentono a determinare i meccanismi molecolari sottostanti gli effetti in vivo di modificatori del pathway di Notch.
Protocol
Representative Results
Discussion
Canonico tacca di segnalazione dipende le interazioni tra il recettore Notch e i suoi ligandi5. Anche se la maggior parte degli studi sul pathway di Notch considera principalmente l’associazione della tacca e ligandi in cellule vicine (trans), Notch e leganti delle stesse cellule interagiscono e questi cosiddetti cis-interazioni possono giocare un ruolo inibitorio nella tacca segnalazione di3,4. Di conseguenza, a decifrar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono supporto da NIH/NIGMS (R01GM084135 a HJN) e Mizutani Foundation per Glycoscience (grant #110071 a HJN) e sono grato a Tom V. Lee per discussioni e suggerimenti sui saggi e Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine e la Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) per plasmidi e linee cellulari.
Materials
| BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified | Lonza | 04-351Q | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare lifescience | SV30010 | |
| CELLSTAR 6 well plate | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| CELLSTAR 24 well plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| VWR mini shaker | Marshell Sceintific | 12520-956 | |
| Hemocytometer | Fisher Sceintific | 267110 | |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| MEGAscrip T7 Transcription Kit | Ambion | AM1334 | |
| Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) | Zymo Research | R1054 | |
| VistaVision Inverted microscope | VWR | ||
| 9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software | AmScope | MU-900 | Image acquisition using ToupView software |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| Fetal Bovine Serum | GenDepot | F0600-050 | |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | HY068-L6 | |
| Copper sulphate | Macron Fine Chemicals | 4448-02 | |
| S2 cells | Invitrogen | R69007 | |
| S2-SerrateTom cells | Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013) | ||
| S2-Delta cells | DGRC | 152 | |
| S2-Notch cells | DGRC | 154 | |
| pMT-Delta vector | DGRC | 1021 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pMT-Serrate vector | Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003) | ||
| pMT-Notch vector | DGRC | 1022 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pAc5.1-EGFP | Gift from Hugo Bellen | ||
| TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit | Applied Biosystem | 1611091 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) | Applied Biosystem | Dm02144576_g1 | with FAM-MGB dye |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) | Applied Biosystem | Dm02151827_g1 | with FAM-MGB dye |
| Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystem | 4351405 | 96-well Block module |
References
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