خلية "التجميع فحوصات" لتقييم ربط الشق المورفولوجية مع ترانس-يغاندس وتثبيط عن طريق رابطة الدول المستقلة-يغاندس
Summary
تعقد النظم في فيفو يجعل من الصعب التمييز بين التنشيط وتثبيط مستقبلات الشق ترانس-و رابطة الدول المستقلة-يغاندس، على التوالي. نقدم هنا، بروتوكول يستند في المختبر فحوصات الخلية-تجميع للتقييم النوعي والكمي شبه ملزمة للشق المورفولوجية عبر-يغاندس مقابل رابطة الدول المستقلة-يغاندس.
Abstract
مما يشير إلى درجة نظام اتصالات تقحم مصانة خلية-خلية تستخدم على نطاق واسع في التنمية الحيوانية وصيانة الكبار. التفاعل بين مستقبلات الشق يغاندس من الخلايا المجاورة الحث على تفعيل المسار إشارات (ترانس-التنشيط)، في حين أن التفاعل مع يغاندس من نفس الخلية يحول دون إشارة (رابطة الدول المستقلة-تثبيط). التوازن السليم بين ترانس-التنشيط و رابطة الدول المستقلة-تثبيط يساعد على تحديد المستويات المثلى للشق إشارات في بعض السياقات أثناء التنمية الحيوانية. بسبب تداخل مجالات التعبير الشق ويغاندس به في العديد من أنواع الخلايا، ووجود آليات التغذية المرتدة، دراسة آثار التعديل بوستترانسلاشونال معين في ترانس-مقابل رابطة الدول المستقلة-التفاعلات من الدرجة الأولى و أن يغاندس في فيفو أمر صعب. هنا، يمكننا وصف بروتوكول لاستخدام المورفولوجية S2 الخلايا في خلية-تجميع فحوصات لتقييم آثار إسقاط معدل مسار الشق على الربط من الدرجة الأولى لكل من يجند في ترانس وفي رابطة الدول المستقلة. خلايا S2 transfected ثابت أو عابر مع ناقل التعبير عن الشق مختلطة مع خلايا معربا عن كل من يجند الشق (S2-دلتا أو S2 سيراتي). ترانس-الربط بين مستقبلات ويغاندس النتائج في تشكيل خلية الغيروية المجاميع ويقاس من حيث عدد المجاميع كل مل تتألف من > 6 خلايا. لدراسة تأثير المثبطة رابطة الدول المستقلة-يغاندس، خلايا S2 المشترك معربا عن الشق ويجند كل مختلطة مع خلايا دلتا S2 أو S2 سيراتي وعدد المجاميع هي كمياً كما هو موضح أعلاه. الانخفاض النسبي في عدد المجاميع بسبب وجود رابطة الدول المستقلة-يغاندس يوفر مقياسا رابطة الدول المستقلة-يجند-بوساطة تثبيط ترانس-ملزمة. يمكن أن توفر بيانات شبه كمي عن آثار التلاعبات الجينية أو الدوائي على الربط من الدرجة لما يغاندس هذه الاختبارات مباشرة، ويمكن أن تساعد في فك رموز الآليات الجزيئية الكامنة في فيفو آثار مثل هذا التلاعب في الشق الإشارات.
Introduction
يشير الشق الكنسي هو إليه قصيرة المدى لخلية اتصال تتطلب الاتصال الجسدي من الخلايا لتيسير التفاعل بين مستقبلات الشق و يغاندس1المجاورة. التفاعل بين مستقبلات الشق (موجودة على سطح الخلايا المستقبلة للإشارات) يغاندس (موجودة على سطح إرسال إشارة الخلايا) يبدأ الشق الإشارات ويعرف باسم ترانس-التنشيط2. من ناحية أخرى، يؤدي إلى تثبيط مسار درجة التفاعل بين الشق وبه يغاندس في نفس الخلية ويعرف باسم رابطة الدول المستقلة-تثبيط3. التوازن بين ترانس-و رابطة الدول المستقلة-التفاعلات مطلوب لضمان المثلى تعتمد على يجند الشق مما يشير إلى4. المورفولوجية له مستقبلات حز واحد واثنين من يغاندس (دلتا وسيراتي) بدلاً من الثدييات، التي لها أربعة مستقبلات الشق ويغاندس خمسة [خشنة 1 (JAG1)، JAG2، مثل دلتا 1 (DLL1)، DLL3 و DLL4]5. يوفر الطراز المورفولوجية السهولة تشريح ودراسة آثار معدلات المسار في الدرجة-يجند التفاعلات وبعد ذلك في الدرجة الأولى مما يشير إلى أن وجود هذه البساطة،. في سياقات معينة أثناء التنمية الحيوانية (بما في ذلك تطوير الجناح في المورفولوجية)، رابطة الدول المستقلة-و عبر-تشارك التفاعلات لتحقيق إشارات الدرجة المناسبة وخلية مصير1،6 . من المهم التمييز بين آثار الشق مسار المعدلات في هذه السياقات على- رابطة الدول المستقلةمقابل ترانس-التفاعلات من الدرجة الأولى مع ما يغاندس.
وذكرت مجموعتنا سابقا أن ينظم إضافة بقايا الكربوهيدرات تسمى إكسيلوسي إلى درجة المورفولوجية سلبا على الشق إشارات في سياقات معينة، بما في ذلك تطوير الجناح7. فقدان شمس (الإنزيم إكسيلوسيلاتيس هذا الشق) يؤدي إلى النمط الظاهري “خسارة الوريد الجناح”7. في الآونة الأخيرة، استخدمت الجينات الجرعة التجارب وتحليل الاستنساخ لإظهار أن يعزز فقدان شمس الشق دلتا بوساطة أفراد. للتمييز بين ما إذا كان يشير الشق المعززة في طفرات شمس نتيجة ل انخفاض رابطة الدول المستقلة-تثبيط أو زيادة ترانس-التنشيط، ودراسات overexpression حمل خارج الرحم من يغاندس الشق في الجناح اليرقات إيماجينال أقراص وأجريت باستخدام برنامج التشغيل GAL4 الحزب الديمقراطي التقدمي . هذه التجارب قدم أدلة تشير إلى أن شمس ينظم ترانس-تفعيل الشق بدلتا دون التأثير على الدرجة رابطة الدول المستقلة-تثبيط يغاندس8. إلا أن التغذية المرتدة اللوائح وآثار يغاندس الذاتية قد يؤدي إلى تعقيد تفسير overexpression حمل خارج الرحم الدراسات1،،من69.
لحل هذه المشكلة، خلايا S2 المورفولوجية واستخدمت10 ، التي توفر نظام بسيط في المختبر ليجند درجة التفاعل الدراسات11،12. خلايا S2 لا التعبير عن مستقبلات درجة الذاتية ودلتا يجند11 والتعبير عن مستوى منخفض من سيراتي13، التي لا تؤثر على الشق-يجند تجميع التجارب8. ولذلك، الخلايا S2 يمكن أن يكون ثابت أو عابر transfected الشق و/أو يغاندس الفردية (دلتا أو سيراتي) لتوليد الخلايا التي تعبر حصرا عن مستقبلات الشق أو واحد من يغاندس على، أو مزيج منها. خلط الخلايا معربا عن الدرجة S2 مع الإعراب عن يجند S2 خلايا النتائج في تشكيل المجاميع الغيروية توسط يجند مستقبلات ملزم11،،من1214. التحديد الكمي لتشكيل الكلية توفر قدرا من ترانس-الربط بين الدرجة و يغاندس15 (الشكل 1). وبالمثل، يمكن أن تكون الخلايا S2 transfected اشتركت مع يغاندس الشق ودلتا أو سرت (أي رابطة الدول المستقلة-يغاندس). رابطة الدول المستقلة-يغاندس في هذه الخلايا معربا عن الدرجة S2 إلغاء الربط من الدرجة الأولى مع ترانس-يغاندس وتؤدي إلى تناقص تشكيل إجمالي8،،من1214. الانخفاض النسبي في تشكيل الإجمالية الناجمة عن رابطة الدول المستقلة-يغاندس يوفر مقياسا لتأثير المثبطة رابطة الدول المستقلة-يغاندس على الربط بين الدرجة و عبر-يغاندس (الشكل 2). تبعاً لذلك، استخدمت خلية التجميع فحوصات فحص أثر فقدان إكسيلوسيليشن في ترانس-و رابطة الدول المستقلة-التفاعلات بين الشق وبه يغاندس.
هنا، فإننا نقدم بروتوكول مفصل لفحوصات تجميع الخلية بهدف تقييم الربط من الدرجة الأولى مع ترانس-يغاندس وتثبيط عن طريق رابطة الدول المستقلة-يغاندس استخدام الخلايا S2 المورفولوجية . على سبيل مثال، نحن نقدم البيانات التي سمحت لنا بتحديد أثر الشق إكسيلوسيليشن على الربط بين الدرجة و عبر-دلتا8. هذه الاختبارات مباشرة توفر تقييما شبه كمي للدرجة-يجند التفاعلات في المختبر ، وتساعد في تحديد الآليات الجزيئية الكامنة وراء الآثار في فيفو الشق مسار المعدلات.
Protocol
Representative Results
Discussion
يشير الشق الكنسي يعتمد على التفاعلات بين مستقبلات الشق و يغاندس5. على الرغم من أن معظم الدراسات في المسار الشق النظر أساسا الربط من الدرجة الأولى ويغاندس في الخلايا المجاورة (ترانس)، تتفاعل الشق ويغاندس نفس الخلية، وهذه ما يسمى رابطة الدول المستقلة-التفاعلات يمكن أن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب الاعتراف بدعم من المعاهد الوطنية للصحة/نيجمس (R01GM084135 هجن) ومؤسسة ميزوتاني جليكوسسينسي (منحة #110071 هجن)، وهي ممتنة للي ف توم للمناقشات والاقتراحات المتعلقة الاختبارات، وسبيروس أرتافانيس-تساكوناس، “هوغو بيلين”، روبرت فليمينغ، إيرفين كين ومركز الموارد الجينومية المورفولوجية (دجرك) البلازميدات وخطوط الخلية.
Materials
| BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified | Lonza | 04-351Q | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare lifescience | SV30010 | |
| CELLSTAR 6 well plate | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| CELLSTAR 24 well plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| VWR mini shaker | Marshell Sceintific | 12520-956 | |
| Hemocytometer | Fisher Sceintific | 267110 | |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| MEGAscrip T7 Transcription Kit | Ambion | AM1334 | |
| Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) | Zymo Research | R1054 | |
| VistaVision Inverted microscope | VWR | ||
| 9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software | AmScope | MU-900 | Image acquisition using ToupView software |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| Fetal Bovine Serum | GenDepot | F0600-050 | |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | HY068-L6 | |
| Copper sulphate | Macron Fine Chemicals | 4448-02 | |
| S2 cells | Invitrogen | R69007 | |
| S2-SerrateTom cells | Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013) | ||
| S2-Delta cells | DGRC | 152 | |
| S2-Notch cells | DGRC | 154 | |
| pMT-Delta vector | DGRC | 1021 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pMT-Serrate vector | Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003) | ||
| pMT-Notch vector | DGRC | 1022 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pAc5.1-EGFP | Gift from Hugo Bellen | ||
| TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit | Applied Biosystem | 1611091 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) | Applied Biosystem | Dm02144576_g1 | with FAM-MGB dye |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) | Applied Biosystem | Dm02151827_g1 | with FAM-MGB dye |
| Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystem | 4351405 | 96-well Block module |
References
- de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).
- Fortini, M. E. Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation. Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).
- del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling. Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).
- Sprinzak, D., et al. Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states. Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).
- Kopan, R., Ilagan, M. X. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
- Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis. Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).
- Lee, T. V., et al. Negative regulation of notch signaling by xylose. PLoS Genet. 9 (6), e1003547 (2013).
- Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila. PLoS Genet. 13 (4), e1006723 (2017).
- Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila. Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).
- Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
- Fleming, R. J., et al. An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling. Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).
- Saj, A., et al. A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network. Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).
- Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila. Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).
- Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling. J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe. J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).
- Acar, M., et al. Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling. Cell. 132 (2), 247-258 (2008).
- Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions. Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).
- Yamamoto, S., et al. A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands. Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).
