خالية من المنظفات فائق السرعة إعادة تشكيل بروتينات الغشاء إلى بليرس الدهن باستخدام فوسوجينيك بروتيوليبوسوميس تكميلية مشحونة.
Summary
نقدم هنا البروتوكولين فائق السرعة لإعادة تشكيل بروتينات الغشاء في بروتيوليبوسوميس فوسوجينيك، ومزيج من هذه بروتيوليبوسوميس مع بليرس الدهون المستهدفة لتوصيلها المنظفات خالية من هذه البروتينات الغشاء إلى بلير بوستفوسيون. أن الجمع بين هذين النهجين يمكن الجمعية التي تسيطر عليها بسهولة وسرعة من أنظمة الأغشية المتعددة العناصر المعقدة.
Abstract
المنظفات لا غنى عنها لإيصال بروتينات الغشاء إلى 30-100 نانومتر الحويصلات أونيلاميلار الصغيرة، بينما بليرس الدهن نموذج أكثر تعقيداً وأكبر أقل توافقاً مع المنظفات.
هنا يصف لنا استراتيجية لتجاوز هذا القيد الأساسي استخدام فوسوجينيك اتهم معاكس الدهنية تحمل بروتين غشائي للفائدة. يحدث الانصهار بين هذه الحويصلات داخل 5 دقيقة في المخزن مؤقت منخفضة قوة الأيونية. يمكن استخدام الدهنية فوسوجينيك مشحونة بشكل إيجابي كمتجهات مكوك البسيط لتوصيلها خالية من المنظفات البروتينات الغشاء إلى المحاكاة البيولوجية المستهدفة دهن بليرس، الذي يتوجب سلبا. ونحن كما تظهر كيفية إعادة تشكيل بروتينات الغشاء في بروتيوليبوسوميس فوسوجينيك مع بروتوكول سريع 30 دقيقة.
الجمع بين هذين النهجين، نظهر جمعية بسرعة الإلكترون النقل سلسلة تتألف من اثنين من البروتينات الغشاء من كولاي، مضخة بروتون الابتدائي بو3-أوكسيديز وو1وس ATP synthase، في أغشية من الحويصلات من مختلف الأحجام، تتراوح ما بين 0.1 إلى > 10 ميكرون، فضلا عن إنتاج ATP بهذه السلسلة.
Introduction
الروغان من الدهن الاصطناعي بليرس مع بروتينات الغشاء خطوة أساسية في الجمعية للغشاء نظم نموذجية. النموذج الأبسط، بروتيوليبوسوميس (رر)، يتكون من الصغيرة (قطرها 30-200 نانومتر) إدماج الحويصلات أونيلاميلار (سيارات الدفع الرباعي، كما دعا الدهنية)، مع البروتينات على أغشية. وتشكل تقليديا رر في اثنين خطوات1. سيارات الدفع الرباعي أولاً، بريفورميد مختلطة مع بروتين غشائي الفائدة ومطهر بتركيز أعلى تركيز مذيل الحرجة (CMC). ثانيا، يتم إزالة مواد التنظيف مع مختلف تقنيات الترشيح الغسيل الكلوي أو “بيو-الخرز” أو هلام، تاركاً البروتين في الغشاء. هذا النهج الأخير هو كثير أسرع (~ 30 دقيقة1) وهو الأفضل لإعادة تشكيل بروتينات الغشاء الهشة والحساسة، ولذلك حين النهجين أولاً محدودة بسرعة إزالة المنظفات، والتي تستغرق عدة ساعات، وقد يسبب خسارة كبيرة للنشاط وفقدان السلامة الهيكلية للبروتينات. الروغان من أكبر حويصلات (أونيلاميلار كبير الحويصلات، لوف، ما يصل إلى 1 ميكرومتر القطر) من هذا النهج أكثر صعوبة، حويصلة يحصل على تخفيض حجم بعد إزالة مواد التنظيف، ومن غير الممكن للحويصلات أونيلاميلار العملاقة (جوف، > 1 ميكرومتر)، فضلا عن أنها تؤدي إلى زعزعة المنظفات (ولكن انظر جونسون et al. 2 لبطء 2D-بلورة البروتينات الغشاء في بليرس كبيرة). النهج البديلة جيوف غشاء الروغان3،،من45 موجودة بل هي شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً، ولا تزال تتطلب بعض المنظفات بتركيزات أقل CMC. لا يمكن أن تتسامح أكثر تعقيداً أو الهشة الدهن نماذج (على سبيل المثال، “بليرس المائية الحبرية”6 و 3D أنسجة اصطناعية للطباعة المستندة إلى “واجهة الحبرية بلير”7) المنظفات. الناشئة بسرعة تطبيقات البيولوجيا التركيبية8،9،10 خطيرة تعتمد على الروغان من هذه الهياكل غشاء معقدة. ولذلك يلتمس طريقة سهلة وقوية مما يتيح تسليم سريع ولطيف بروتينات الغشاء بيلاييرس الهشة الهدف عاليا في الميدان.
بديل، هو أسلوب التسليم البروتين خالية من المنظفات حويصلة الانصهار، حيث توحد الأغشية المتفاعلة حويصلات إلى بلير بوستفوسيون سليمة، بينما يحصل مختلطة محتوياتها المائية إينترافيسيكولار، دون أن يطلق سراحه في الخارجية البيئة. يتم تمكين حويصلة الانصهار ومدفوعة أما بترتيبات جديدة conformational ضمن عوامل مكملة فوسوجينيك (بعض البروتينات11،12 والببتيدات13 أو تعديل خصيصا الحمض الخلوي الصبغي14) يقع في الاتصال بيلاييرس، أو كولومبيك التفاعلات بين بيلاييرس الدهون تشكل الدهون أنيونى والموجبة مشحونة بالتكامل15،16، أو بيلاييرس الموجبة وبروتينات مشحونة سلبا على17.
النهج السابق الذي يتطلب وجود عوامل فوسوجينيك في أغشية متفاعلة فيما بينها قبل الانصهار، بطيئة نسبيا (~ 30 دقيقة للوصول إلى النصف-الحد الأقصى من الانصهار12،18)، ولكن يمكن تطبيقها على سواء الطبيعية أو الاصطناعية الأغشية.
ميزة نهج استخدام الدهون فوسوجينيك (الشكل 1) أنه يمكن الكثير أسرع من الانصهار غشاء (~ 1 دقيقة تصل إلى نصف الحد الأقصى، و 5-10 دقيقة للانتهاء من رد فعل). بالإضافة إلى ذلك، يمكن التحكم في مدى الانصهار التي ط) وسيلة سهلة لصياغة المحتوى النسبي الدهون مشحونة في بليرس فوسوجينيك، والثاني) الأيونية، وبصفة عامة، ناضح وقوة رد الفعل المتوسطة (أملاح في أعلاه 50 ملم، وعلى سبيل المثال، السكروز15 يتم عرض لوقف الانصهار)، أو مزيج من كليهما. للشروع في الانصهار، تختلط الحويصلات فوسوجينيك المشحونة معاكس في متوسط قوة الأيونية منخفض (عادة 10-20 مم الملح) لمدة 5-10 دقائق. عيب نسبي للأسلوب هو أن الدهون الموجبة قد تمارس تأثيراً سلبيا على الأداء الوظيفي للبروتينات الغشاء في بروتيوليبوسوميس الموجبة قبل الانصهار، لا سيما في قوة الأيونية ضعيفة، ولكن هذا التأثير يتم عكسها وتخفيفها بطبيعية تكوين الدهن الغشاء بعد الانصهار وعودتها إلى متوسطة القوة الأيونية العادي.
Protocol
Representative Results
Discussion
فيما يلي عدد قليل من القضايا بحاجة إلى النظر لنجاح هذا النهج التجريبي:
خيار للدهن بليرس بروتيوليبوسوميس والهدف: الدهون الموجبة ليست موجودة في الطبيعة، بينما الدهون أنيونى وفيرة في الأغشية البيولوجية التوصل إلى، على سبيل المثال، ~ 25 و 35 و 20% في الغشاء الداخلي كولاي، غشاء البلازما للخميرة S. cerevisiaeوأغشية الميتوكوندريا الداخلية العديد من الأنواع، على التوالي27،،من2829. أنه سيكون من المعقول أن نتوقع أن الأداء الوظيفي للبروتينات الغشاء في رر+ قد تتأثر بقوة شحنة موجبة لبلير، الذي يتوقف بدوره على محتوى نسبي من الدهن الأيوني في بلير والخارجية الأيونية القوة. ولذلك، من المهم أن تعالج تجريبيا إلى أي مدى سيتوقف الأداء الوظيفي للبروتينات الغشاء للفائدة على المسؤول عن البيئة الدهون الموجبة. هنا، نحن تبين أن كلا و1وo ATP synthase وبو3-أوكسيديز حساسة للبيئة الدهن الأيوني، ولكن استطعنا أن تعدل، وعكس هذا التأثير من خلال وضع البروتينات في رر+ الأولى وتسليمها إلى أنيونى قبول بيلاييرس ومن ثم زيادة القوة الأيونية للمتوسط رد فعل بعد الانصهار يتم الانتهاء.
الخيار دهن الموجبة خاصة: معظم الدهون الموجبة المتاحة تجارياً ذات طبيعة غير ترياسيلجليسيريدي؛ ولذلك يجب اختبارها دهن مرشح محتمل للتوافق مع بروتينات الغشاء للفائدة. لقد وجدنا سابقا15 التي أظهرت ATP synthase المستخدمة في هذه الدراسة تشكل أفضل أداء في رر+ إيثيل-جهاز الكمبيوتر، والتي لديها أعلى التشابه الهيكلي للدهون ترياسيلجليسيريدي الطبيعية، بينما في دوتاب (غير ترياسيلجليسيريدي دهن) رر+ هذا البروتين كانت أقل نشاطا.
فحوصات الانصهار حويصلة: الانصهار الحقيقي حويصلة (عند مزج المحتويات السائلة إينترافيسيكولار) يحتاج أن يكون ميزت من الدول هيمي-فيوجن الوسيطة، عندما حويصلات التقيد ببعضها البعض دون خلط محتواها المائي، ولكن سهولة خلط المحتويات الخارجية أو كلا الدهن منشورات30. في حالة المخاليط الدهن دون الحد الأمثل أو شروط معينة، تظهر حويصلات أيضا تسرب المحتويات السائلة وضوحاً خلال الانصهار31. تركيزات ضئيلة الدهون مشحونة في خلائط فوسوجينيك تمكين الانصهار الحقيقي بحاجة إلى الاطلاع على تجريبيا لكل أنواع الدهون، ولكن عموما، أنها وجدت أن الأغشية بأقل من 10% اتهم تستخرج الدهون غير فوسوجينيك 32.
بينما تشكل فوسوجينيك سيارات الدفع الرباعي في وجود أيونات متعددة-بالينت، من المهم لا لخلط مكونات المشحونة معاكس، كما قد يتسبب هذا التثاقل الفوري وتراكم للدهون بهذه الأيونات. على سبيل المثال، أثناء إعداد سيارات الدفع الرباعي لأسلوب الكوبالت-كالسين-يدتا، من المهم تجنب خلط خليط دهن الموجبة مع أدتا الحيلولة دون انسداد فلتر البولي بمكونات تحبب خفيف.
من المهم أيضا أن نذكر أن الأسلوب الكوبالت-كالسين-يدتا، بينما يجري حساسة جداً ومريحة للرصد في الوقت الحقيقي الانصهار، قد لا يزال يقلل من مدى الانصهار سبب 1) تبريد ذاتي للأسفار كالسين الحرة داخل حويصلات بوستفوسيون، التي من المتوقع أن تصل إلى 1 مم، بينما عتبة التبريد الذاتي وتفيد التقارير أن حوالي 20 ميكرومتر33، و 2) سطح زمنياً الكوبالت-كالسين، الذي يظل ملزما بالدفع الرباعي+ حتى بعد مرورها عبر الراتنج هلام الترشيح و ألوان الحويصلات إلى لون برتقالي مشرق، بينما سيارات الدفع الرباعي0 لها لون برتقالي شاحب. لاحظ أيضا أن الإفراج عن الكوبالت-كالسين منضم عند إضافة المنظفات X-100 تريتون حضور يدتا يولد إشارات أقوى بكثير لسيارات الدفع الرباعي+ (الشكل 3، تتبع الأحمر) من سيارات الدفع الرباعي0 (تتبع الرمادية).
وجهات النظر: أننا نتوقع أن النهج السريع الموصوفة هنا قد إلى حد كبير تيسير وتسريع الجمعية الأغشية المعقدة لتلبية الاحتياجات الناشئة في تطبيقات البيولوجيا التركيبية. لدينا بروتوكول إعادة تشكيل البروتين الغشاء يأخذ سوى نصف ساعة لإعادة تشكيل بروتينات الغشاء كبيرة الهشة المعروفة لتكون حساسة لتقنيات إعادة تشكيل مطولة المستندة إلى الغسيل الكلوي، وبينما يأخذ هذا النهج فوسوجينيك فقط 5-10 دقيقة لتسليم هذه البروتينات في بيلاييرس دهني كبير. هنا، نحن إثبات مزايا هذه النهج عن طريق التلاعب كولاي و1وس ATP synthase، الذي مثال للبروتين الهشة. أنها مصنوعة من مفارز 23 وهو معروف بسهولة تفقد سلامتها إذا ما تعرضوا لظروف دون المستوى الأمثل (على سبيل المثال، الحرارة) أثناء أو بعد solubilization، لكن المستخدمة في هذه الإجراءات، يوضح البروتين تكاثر عالية النشاط في ضخ البروتون.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلف شاكرون جينيس روبرت من جامعة إلينوي وكريستوف فون بالموس من جامعة بيرن لتوفير بلازميد وسلالة للتعبير عن بو3-أوكسيديز. المشروع وأيده BBSRC منحة BB/L01985X/1 R.I. وسنغ
Materials
| DOPC neutral lipid | Avanti Lipids | 850375 | |
| POPA anionic lipid | Avanti Lipids | 840857 | |
| E-PC cationic lipid | Avanti Lipids | 890704 | |
| Cholesteryl-Bodipy-FL12 | Thermofisher | C3927MP | |
| Sephadex G-50, Super Fine | Sigma | G5050 | |
| Ficoll 400, Type 400-DL | Sigma | F8016 | |
| ACMA | Sigma | A5806 | |
| Nigericin | Sigma | N7143 | |
| ATP | Sigma | A26209 | |
| Q1 | Sigma | C7956 | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| PEP | Sigma | 860077 | |
| NADH | Sigma | N8129 | |
| PK | Sigma | P9136-1KU | |
| LDH | Sigma | L1254-1KU | |
| Luciferin | Sigma | L6882 | |
| Luciferase | Sigma/Roche | 10411523001 | |
| Calcein | Insight Biotechnology | sc-202090 | |
| CoCl2 | Sigma | C8661 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Sulforhodamine 101 | Sigma | S7635 | |
| Extrusion system | Avanti Extruder | ||
| Single tube luminometer, model Sirius L | Titertek Berthold | ||
| Polycarbonate filter, D19 mm | Sigma, Whatman NucleporeTrack-Etched Membranes | WHA800309, WHA800284 | 100 or 200 nm to form SUV, and 400 or 800 nm for LUV |
| Buffers used in the paper | Composition | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer A | 100 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7.4, 1 mM MgCl2 | ||
| Buffer B | 20 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4, 0.1 mM MgCl2 | ||
| Buffer C | 100 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4 | ||
| Buffer D | 1 mM MOPS pH 7.4 Various concentrations of KCl |
References
- Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Liposomes, Pt B. 372, 65-86 (2003).
- Johnson, M., et al. Two-dimensional crystallization of membrane proteins by reconstitution through dialysis. Methods Mol Biol. 955 (31-58), 31 (2013).
- Dezi, M., et al. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proc Nat Acad Sci U S A. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Girard, P., et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophys J. 87 (1), 419-429 (2004).
- Angelova, M., et al. Preparation of Giant Vesicles by External Ac Electric-Fields – Kinetics and Applications. Trends in Colloid and Interface Science Vi. 89, 127-131 (1992).
- Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
- Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. A Tissue-Like Printed Material. Science. 340 (6128), 48-52 (2013).
- Khalil, A. S., Collins, J. J. Synthetic biology: applications come of age. Nat Rev Genet. 11 (5), 367-379 (2010).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Lett. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Church, G., et al. Realizing the potential of synthetic biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (4), 289-294 (2014).
- Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337 (6100), 1340-1343 (2012).
- Nordlund, G., Brzezinski, P., von Ballmoos, C. SNARE-fusion mediated insertion of membrane proteins into native and artificial membranes. Nat Commun. 5, 4303 (2014).
- Decout, A., et al. Enhanced efficiency of a targeted fusogenic peptide. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes. 1372 (1), 102-116 (1998).
- Chan, Y. H., van Lengerich, B., Boxer, S. G. Effects of linker sequences on vesicle fusion mediated by lipid-anchored DNA oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (4), 979-984 (2009).
- Ishmukhametov, R. R., Russell, A. N., Berry, R. M. A modular platform for one-step assembly of multi-component membrane systems by fusion of charged proteoliposomes. Nat Commun. 7, 13025 (2016).
- Biner, O., et al. Delivery of membrane proteins into small and giant unilamellar vesicles by charge-mediated fusion. FEBS Lett. 590 (14), 2051-2062 (2016).
- Bian, T., et al. Direct detection of SERCA calcium transport and small-molecule inhibition in giant unilamellar vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 481 (3-4), 206-211 (2016).
- Schuette, C. G., et al. Determinants of liposome fusion mediated by synaptic SNARE proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (9), 2858-2863 (2004).
- Spencer, A. C., Torre, P., Mansy, S. S. The encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics. J Vis Exp. (80), e51304 (2013).
- Verchere, A., et al. In vitro investigation of the MexAB efflux pump from Pseudomonas aeruginosa. J Vis Exp. (84), e50894 (2014).
- Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. Determination of Microgram Quantities of Protein in the Presence of Milligram Levels of Lipid with Amido Black B-10. Analytical Biochemistry. 150 (1), 97-104 (1985).
- Rumbley, J., et al. One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase. Biochim Biophys Acta. 1340 (1), 131-142 (1997).
- Taussky, H. H., Shorr, E. A Microcolorimetric Method for the Determination of Inorganic Phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 202 (2), 675-685 (1953).
- Galkin, M. A., Ishmukhametov, R. R., Vik, S. B. A functionally inactive, cold-stabilized form of the Escherichia coli F1Fo ATP synthase. Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757 (3), 206-214 (2006).
- Ishmukhametov, R. R., Galkin, M. A., Vik, S. B. Ultrafast purification and reconstitution of His-tagged cysteine-less Escherichia coli F1Fo ATP synthase. Biochim Biophys Acta. 1706 (1-2), 110-116 (2005).
- Wiedenmann, A., Dimroth, P., von Ballmoos, C. Deltapsi and DeltapH are equivalent driving forces for proton transport through isolated F(0) complexes of ATP synthases. Biochim Biophys Acta. 1777 (10), 1301-1310 (2008).
- Morein, S., et al. Wild-type Escherichia coli cells regulate the membrane lipid composition in a "window" between gel and non-lamellar structures. J Biol Chem. 271 (12), 6801-6809 (1996).
- Zinser, E., et al. Phospholipid synthesis and lipid composition of subcellular membranes in the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 173 (6), 2026-2034 (1991).
- Daum, G., Vance, J. E. Import of lipids into mitochondria. Prog Lipid Res. 36 (2-3), 103-130 (1997).
- Pantazatos, D. P., MacDonald, R. C. Directly observed membrane fusion between oppositely charged phospholipid bilayers. J Membr Biol. 170 (1), 27-38 (1999).
- Pantazatos, D. P., Pantazatos, S. P., MacDonald, R. C. Bilayer mixing, fusion, and lysis following the interaction of populations of cationic and anionic phospholipid bilayer vesicles. J Membr Biol. 194 (2), 129-139 (2003).
- Sunami, T., et al. Detection of association and fusion of giant vesicles using a fluorescence-activated cell sorter. Langmuir. 26 (19), 15098-15103 (2010).
- Memoli, A., et al. Effects of surfactants on the spectral behaviour of calcein (II): a method of evaluation. J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 627-632 (1999).
