Deterjan-Alerjik membran proteinlerinin Ultrafast sulandırma tamamlayıcı-Proteoliposomes ücret Fusogenic kullanarak Lipid Bilayers içine.

1. fusogenic hazırlanması SUV ve LUV Fusogenic lipid karışımı hazırlanması Kloroform 25-50 mg/mL, tarafsız, Katyonik, Anyonik ve floresan lipidler hisse senedi çözümler hazırlamak (örneğin, tarafsız DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), Katyonik etil-PC (1,2- dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), Anyonik POPA (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphate) ve FL12 Kolesteril Bodipy Floresan, sırasıyla) uygun miktarda kuru lipitler tartma ve onları % 100 eriterek tarafından Kloroform (dikkat! Bunu bir duman başlık altında), ya da ticari olarak mevcut kloroform stokları lipidler kloroform ile sulandrarak.Not: Hem doğal lipid ayıklar ve saf sentetik yağlar kullanılabilir ve benzer sonuçlar gösterilmektedir. Mix 2.5 mg bir Katyonik ve tarafsız bir lipid kloroform hisse senedi (1.1.1) bir cam şişe içinde 2.5 mg.Not: Bu adım 5 mg % 50 ağırlık Katyonik lipidler kısmını içeren kloroform, Katyonik lipit karışımı verir. Gerektiğinde, %0,5 ağırlık bir floresan lipid kısmını karışıma ekleyin. 1 mg Anyonik ve nötr lipitler kloroform stokları (1.1.1) bir cam şişe içinde 4 mg karıştırın. Bu 5 mg % 20 kilo Anyonik lipidler kısmını içeren Anyonik lipid karışımı verir. Kloroform azot kuru lipid ince bir tabaka oluşturmak için bir akarsuyun altında buharlaşır. 10 dk için vakum altında kalan kloroform kaldırmak.Not: Geleneksel olarak çok daha uzun (1-12 h) bu adımı alır ama daha uzun bir tedavi özellikleri SUV kaplin hiçbir belirgin düzelme sağlar bulduk. Her şişe 0.5 mL arabellek A (100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 50 mM BEZLERİ, pH 7,4) ekleyerek ve gideriş onları kadar lipit filmin cam yüzey ve b tamamen müstakil oda sıcaklığında 30 dk ve sonra girdap durmak için Kuru lipit filmin hidrat ecomes homojen lipid süspansiyon. Bu konuda almalısınız 20-40 s. SUV ve LUV oluşumu ile ekstrüzyon Bir ekstrüzyon sistemini monte ( Tablo reçetesigörmek) polikarbonat filtre aşağıdakilerden birini kullanarak iki 1 mL şırınga ile gözenek boyutları: form SUV için 100 ya da 200 nm ve 400 veya 800 nm forma LUV. Lipid süspansiyon bir şırınga aktarın. Süspansiyon filtreden 21 kez, başka bir yerde18,19gösterildiği gibi geçen A’ya.Not: Geçişleri tek sayıda transfer büyük lipid kümeleri orijinal lipid süspansiyon karşı karşıya filtre tarafa sıkışmış vezikül çözüm içine en aza indirmek için gereklidir. Vezikül çözüm 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine aktarın. 2. Fusogenic Şef ters emülsiyon yöntemi tarafından oluşumu Not: Bu yordam Şekil 2′ de gösterilmiştir. Petrol lipid çözüm hazırlanması Kloroform hisse senedi mix (bkz. Adım 1.1.1) tarafsız lipid (2 mg) ve 1 mL hexadecane 1.5 mL microcentrifuge tüp ile Anyonik bir lipid (0.5 mg). Kloroform sürekli karıştırma ve 30 dk tüpü açık tutmak için 80 ° C’de Isıtma altında karışımından buharlaşır. Tüp kapatın ve oda sıcaklığında soğumaya bırakın. Lipid monolayer lipid-içinde-petrol/sulu tampon arayüzüne oluşumu Yer 200 µL üstünde tepe-in 0.5 mL arabellek B (20 mM KCl, 0,1 mM MgCl2, 10 mM BEZLERİ pH 7,4) 1,5 mL santrifüj tüpü petrol lipid çözüm. Faz ayrımı sınır petrol ve sulu tampon (şekil 2A) arasındaki yüzey gerilimini uyumsuzluğu nedeniyle dışbükey şeklinde Not. Faz ayrımı sınır düzleştirir, lipid monolayer oluşumu üzerine göstergesi olduğu kadar bekleyin. Bu genellikle oda sıcaklığında 30-60 dakika sürer. Petrol su emülsiyon hazırlanması Suda çözünen bir iyonik olmayan polisakkarit tampon B, daha su yoğunluğu yüksek yoğunluklu çözüm hazırlamak (örneğin % 15 Ficoll-400 (w/v), yoğunluğu ile 1.05 g/mL)Not: İsteğe bağlı olarak, bir floresan boyalar suda çözünen Şef daha iyi görselleştirme için arabellek ve GUVs diğer herhangi bir istenen sulu içeriği ekleyebilirsiniz. Ayrı 1.5 mL santrifüj tüpü yukarıdaki karışıma 0.5 µL petrol lipid çözeltinin 100 µL ile 2.1.2 aktarmak. Karışımı 30 (14 W 44 kHz) solüsyon içeren temizleyicide s bir ultrasonik su banyosunda. O zaman, şiddetle bir petrol su emülsiyon oluşturmak 45 dk için girdap nerede her damlacık bir lipid monolayer (şekil 2B) kaplı olması. Şef içine yağ su emülsiyon dönüşüm Sonuç emülsiyon lipid-içinde-petrol/sulu arabirimi üstüne yerleştirin ve hemen 2 min için 10.000 x g de masa üstü santrifüj tüpü santrifüj kapasitesi. Şef sonuç Pelet açıkça görülebilir (şekil 2C) olmalıdır. Tüp 4 ° C lipit-içinde-yağ karışımı kuvvetlendirmek için bir buzdolabı için serin (şekil 2B, hexadecane katılaşır 18 ° C altında), donmuş yağ dikkatli bir şekilde çıkarın ve sulu faz tutar.Not: bir tel bir çapa şeklinde bükülmüş kaldırma donma petrol kolaylaştırmak için kullanıldı. Şef Pelet 50 µL taze arabelleği B, transfer için taze bir tüp içinde resuspend ve bir 100 X yağı daldırma hedefi (şekil 2E) kullanarak bir floresan mikroskop altında incelemek. 3. izleme vezikül Fusion kobalt-Calcein yöntemi ile Bir jel-filtrasyon yerçekimi sütun hazırlanması. ~ 10 g jel-filtrasyon reçine (örneğin superfine sephadex G-50) 100 mL deiyonize suyla ıslatın ve gecede şişmesine izin. Reçine 3 mL tek kullanımlık plastik yerçekimi akışı sütuna topla, ultrasaf su ile yıkayın ve arabellek C (100 mM KCl, 10 mM BEZLERİ, pH 7,4) oda sıcaklığında ile equilibrate. SUV+ veya SUV0 hazırlanması kobalt-calcein ile dolu. 1 mM calcein, 1 mM CoCl2, 98 mM NaCl, 10 mM BEZLERİ, içeren bir çözüm hazırlamak sonra pH 7.4 için getirmek.Not: Bu ücretsiz floresan calcein bir floresan kompleks ile Co2 +formlar yöntemi özüdür. Yine EDTA, saatleri eklenmesi floresan olur için Co2 +, daha yüksek ilgi yerinden calcein kobalt-calcein kompleksi (şekil 3A) üzerinden. Bu çözümün 500 µL Katyonik veya nötr lipitler 1. 1’açıklandığı gibi hazır kuru bir film ekleyin. 100 hazırlamak nm SUV 1.2 ile açıklandığı gibi ekstrüzyon tarafından. Masa üstü ultracentrifuge içinde 20 dk için 1.000.000 x g de haddelenmiş SUV cips ve arabellek C1 mL resuspend. Peletleme ve resuspension üç kez tekrarlayın; Arabellek C 0.6 mL için son resuspension kullanın.Not: Aşağıdaki adımları dış kobalt calcein çoğunu kaldırın. Kalan dış kobalt-calcein tarafından geçen SUV üzerinden adım 3.1.2 için açıklandığı gibi C önbellekle equilibrated jel-filtrasyon reçine ile yüklenen tek kullanımlık yerçekimi-akışı sütun kaldırmak.Not: Genellikle ilk mililitre hacmi akışı aracılığıyla atın ve dış kobalt-calcein ücretsiz SUV içeren ikinci mililitre toplamak. EDTA ile yüklenen hazırlanması SUV- Çözüm 10 mm EDTA, 80 mM NaCl, 10 mM BEZLERİ, pH 7.4 hazırlayın. Bu çözümün 500 µL Anyonik lipidler 1. 1’açıklandığı gibi hazır kuru bir film ekleyin. 1. 2’açıklandığı gibi ekstrüzyon SUV- hazırlayın. Cips ve 3.2.4 içinde açıklandığı gibi SUV- resuspend. Kalan EDTA ile 3.2.5 içinde açıklandığı gibi jel-filtrasyon sütun SUV- geçirerek kaldırın. SUV fusion için hazırlanıyor SUV0, SUV+ve SUV- 0.2 mM CoCl2 ve KCl. kullanım 5 µL SUV arabellek d. 1 mL başına her tür istenen konsantrasyonu ile takıma arabellek D (1 mM BEZLERİ, pH 7,4) ile sulandırmak Karışım en az 1 h için kuluçkaya.Not: Bu adımı arka plan Floresans düzeyi bu yüzey SUV+bağlı calcein engelleyerek en aza indirmek olacaktır. Vezikül füzyon Bu füzyon reaksiyonunu SUV+ veya SUV0 1 mL (yukarıda açıklandığı gibi D arabellekte seyreltilmiş) SUV− 1 mL ile karıştırılarak bir 2 mL fluorimeter küvet ve 480 nm uyarma ve 510 nm emisyon kullanarak calcein floresan artan monitör başlatmak (Şekil 3B). Reaksiyon tamamlanması gelene kadar bekle. Deterjan Triton X-100 ve EDTA karışımı ekleyin (% 0.05 son konsantrasyon ve 7 mM, sırasıyla) calcein veziküller dışarı serbest bırakmak ve maksimum Floresans sinyal almak için. Şekil 3 ciçinde gösterildiği gibi deterjan yanı sıra takip maksimum Floresans sinyal yüzdesi olarak tanımlanan füzyon kapsamını belirlemek. 4. hızlı membran proteinlerinin sulandırma Fusogenic Proteoliposomes içine Not: Bu yordam şekil 4Agösterilmektedir. 3. 1’açıklandığı gibi jel-filtrasyon reçine ile yerçekimi akışı sütun hazırlamak ve arabellek A oda sıcaklığında ile equilibrate.Not: Tüm diğer manipülasyonlar, protein aktivite kaybı en aza indirmek için belirtilmedikçe kesinlikle ≤ 4 ° C, yapılmalıdır. 0.7 mg/ml saf membran protein konsantrasyonu protein yalıtımı için kullanılan aynı ayıklama arabellek ile sulandrarak ayarlayın. Ön şekillendirilmesi SUV, 160 µL arabellek A ve 60 µL % 10 cholate arabelleği A, 300 µL ile Mix 140 µL protein; Bu 1:30 verir protein: lipid ağırlık oranı son 660 µL birimindeki. Yavaşça 15dk için sallanan bir platformda karışımı sallayın.Not: Aşağıdaki adımları oda sıcaklığında yapılabilir. Jel-filtrasyon reçine ile karışımı geçmek ve proteoliposomes içeren bulanık kesirleri toplamak. Proteoliposomes ile bir masa üstü ultracentrifuge 15dk için 400.000 x g de cips. Sigara yeniden protein içeren süpernatant atmak ve Pelet 1 mL taze arabellek A. resuspend PL ve20Amido-siyah yöntemi kullanarak süpernatant protein içeriği belirleyin. Sulandırma, verim genellikle yaklaşık % 50-70 olan belirlemek.Not: PL solution’ı 1 mL tek kullanımlık yerçekimi sütuna Paketli ve arabellek ile A 3.1.2 içinde açıklandığı gibi yıkanmış Ni-NTA reçine geçirerek adımları 4.6-4.8 isteğe bağlı olarak değiştirilebilir. Böyle geçen tercihen reçine için PL en hangi akış-aracılığıyla olacak, üzerinden bağlı olmayan yeniden protein ayıracak. 5. Proteoliposomes Protein faaliyet işlevsel testleri Not: Bu çalışmada kullanılan her iki güçlü proton pompa, pompa H+ proteoliposomes onların yüzeylerde eklenmesi üzerine içine proteinlerdir (koenzim Q1 bo3-oksidaz ve ATP için F1Fo, sırasıyla), böylece bina proton degrade boyunca membran (ΔpH). Fusion başarılı co sulandırma durumunda böyle asitleştirme rutin olarak kullanılan bu tür görevleri () için bir pH duyarlı sonda ACMA (9-Amino-6-Chloro-2-Methoxyacridine)12,15, floresan bir düşüş olarak görülebilir Şekil 4B -c). Ayrıca substrat özel etkinlik proteinlerin (koenzim Q1 oksidasyon bo3-oksidaz22 ve ATP hidroliz F1Fo23,24tarafından) izlenebilir spectrophotometrically çeşitli yöntemlerle. Burada, F1Fo PL tahlil (şekil 4 d), iki yerde yenileyici bir ATP kullanarak ATP hidroliz etkinliği göstermektedir enzimler (pyruvate kinaz (PK) ve laktat dehidrogenaz (karaciğer) korumak ATP sürekli konsantrasyon aşağıdaki gibi. PK geri içine onun substrat phosphoenolpyruvate (moral) pahasına ATP F1Fo tarafından üretilen ADP dönüştürerek ATP geri dönüştürür. Bu reaksiyon, ürünü, pyruvate laktat karaciğer NADH, hangi oksidasyonunu izlenen 340, optik yoğunluğu azalan olarak pahasına tarafından dönüştürülmüş nm. Kimyasallar hazırlanması 1 mM etanol ACMA stokta hazır olun. Nigericin 1 mM stokunun (veya herhangi bir diğer uncoupler) etanol hazırlayın. Etanol stokta 25 mM koenzim Q1 ve 1 M DTT stok arabelleği A. hazırlamak Bir stok arabelleği A 100 mm ATP hazırlamak ve onun pH 7.4 için ayarlayın. Stokları sistem bileşenlerinde arabellek A: 100 mM PEP, 1 mM NADH ve PK ve karaciğer Solutions’da konsantrasyon ~ 500-1000 Yenileyici ATP hazırlamak adet/mL. Bo3tarafından pompalama koenzim Q1 oksidasyon tahrik proton-oksidaz PL 0.5 µM ACMA huzurunda fluorimeter küvet ile 2 mL arabellek A 20 µL pl eklemek ve 430 nm uyarma ve 515 nm emisyon kullanarak kararlı sinyali kadar bekleyin. 40 µM koenzim Q1 küvet için ekleyin. PL (şekil 4B) 2 mM DTT ekleyerek proton pompalama başlasın.Not: DTT oksitlenmiş koenzim Q1 azaltır ve bo3için kullanılabilir hale getirir-oksidaz. Kurulan ΔpH 2 µM uncoupler (örneğin nigericin) ekleyerek dağıtmak. ACMA Floresans sinyal hızlı bir şekilde neredeyse orijinal seviyeye döndürmelidir.Not: Olmalı yok ACMA belgili tanımlık substrate eklenmesi Şoklama uncoupler reaksiyon karışımı başlangıçta varsa. ATP hidroliz tahrik proton pompalama F1Fotarafından PL 40 µL pl bir fluorimeter küvet 5,2 açıklandığı gibi ekleyin. PL (şekil 4 c) 0.2 mM ATP ekleyerek proton pompalama başlasın. ΔpH 5.2.4’ten içinde açıklandığı gibi dağıtmak. ATP hidroliz F1FoPL ve onun stimülasyon uncoupler tarafından PL 40 µL 2 mL arabellek A, içeren 1 mM ATP, 0.2 mM NADH, 2 mM PEP, ile Spektrofotometre küvet için ve 15 µL her PK ve karaciğer ekleyin. 340, NADH Absorbans azalma ölçerek reaksiyon izleyin nm. 3-4 dk sonra ΔpH ATP hidroliz üzerinde backpressure serbest bırakmak için küvet için 2 µM uncoupler ekleyin. Reaksiyon hızı hemen yükseltmeniz gerekir.Not: 4.10 içinde açıklandığı gibi Ni-NTA reçine geçtiğini PL uncoupler (şekil 4 d, kırmızı izle), tarafından en güçlü stimülasyon koyacak eluate zar zor uyarılmış (Mavi izle) olacak iken. 6. Fusogenic Proteoliposomes Lipid çevre ve iyonik gücü etkisi membran proteinlerinin işlevselliğini test Tarafından 40 µL proton pompalama değerlendirmek PL+,- PL ve PL0 ACMA 2 mL su verme tahlil ile 1 mM MgCl2 ve 20 (5 rakam, Panel A) veya 100 mM KCl (Masası 5.2 veya 5.3 (şekil 5 tanımlandığı şekliyle B) ile takıma D tampon kırmızı, siyah ve mavi izler). Pl+ 40 µL LUV- aynı birim arabellek 20 mM KCl ve ACMA su verme (yeşil izle) için test ile takıma D 2 ml ile sigorta. Adım 2 gibi kontrol deneyleri, örneğin, PL ve SUV aynı ücret (gri izle) karıştırarak çalıştırın.Not: Proton pompalama tarafından postfusion PL. geliştirilmiş 7. teslim membran proteinlerinin LUV ve Şef Fusogenic Proteoliposomes tarafından PL+ 50 µL 50 µL 800 ile sigorta nm LUV- arabellek 1 mM MgCl2ve 5 min için 20 mM KCl D 1 ml. Veziküller 6.000 x g 5 min için de cips ve süpernatant içeren unreacted PL+atın. Pelet arabellek D 1 mM MgCl2 ve 100 mM KCl ile 1 ml resuspend ve peletleme ve iki kez daha fazla resuspending tekrarlayın. 5.2 veya 5,4 tanımlandığı şekliyle tahlil Şoklama ACMA çalıştırın. Yüksek tuz (200 mM KCl) tamamlayıcı dolu veziküller kombinasyonları, Sigara fusogenic veziküller ve sadece boş LUV- PL+olmadan kullanarak adımları 1-3, olduğu gibi kontrol deneyleri çalıştırın.Not: sadece tamamlayıcı dolu veziküller şekil 6′ da gösterildiği gibi kullanılan zaman postfusion tarafından LUV Proton pompalama tespit edilmelidir. 8. elektron taşıma zinciri LUV membranlar ve Şef ve ATP üretimi bu zinciri tarafından bireysel bileşenlerden Meclisi. Not: Bu yordamın bir şematik şekil 7Agösterilmektedir. Bu deneyde üretilen ATP nerede sentezlenen ATP luciferase tarafından dönüşüm pirofosfat ve AMP içine ışık emisyon bir luminometer ile kayıtlı ardından biyoluminesans-luciferase sistemi tarafından kayıtlı olacak. Bir tek tüp luminometer yerine daha az duyarlı Mikroplaka Luminometreler kullanmanızı öneririz. Mix 3 µL bo3-oksidaz PL+ ve 5 µL F1Fo PL+ oluşan bölüm 4’te açıklandığı gibi. Onlarla 3 µL LUV ya da Şef- (Bölüm 2’de açıklandığı gibi oluşan) arabelleği 20 mM KCl ve 5 min için 1 mM MgCl2 ile takıma D 800 µL sigorta. Yüksek konsantrasyon hisse senetleri kullanarak, KCl ve SÜPÜRGEYİ 100 mM ve 50 mM son konsantrasyon postfusion membranlar için ekleyin.Not: sonrası füzyon LUV durumunda onların şişlik (a tampon) dış arasında ozmotik uzaklığı nedeniyle bu adımı engeller ve intravesicular (arabellek D) konsantrasyon tuzlar. İsteğe bağlı olarak, postfusion membran unreacted SUV+ayırmak için 7.2 içinde açıklandığı gibi cips ve Pelet arabellek A. 800 µL içinde resuspend Bir biyoluminesans-luciferase-ADP kokteyl içeren 400 µM ADP, 50 µM biyoluminesans ve 2,5 µg luciferase tampon A 200 µL hazırlamak Kokteyl Step8.3 postfusion karışıma ekleyin. Postfusion membranlar enerjileme bo3tarafından harekete geçirip, 40 µM okside koenzim Q1eklemek-oksidaz 2 mM DTT ekleyerek. 1 dakika bekle. ATP sentezi için enerjik veziküller 5 mM potasyum fosfat (KPben, pH 7,4) ekleyerek başlatmak ve ATP üretimi ile bir luminometer (şekil 7B) algılamak. Reaksiyon ~ 3 dakika çalıştırın.Not: ATP sentezi tepki için 5-7 dk bo3tarafından tüketilen oksijen tükenmesi kadar devam eder-oksidaz ve luciferase. ATP referans standardı (0.5 nmol ATP) iki kez tepki karışıma ekleyin. Ölçü ATP üretilen. ATP sentezi tepki sinyali ATP referans standart sinyal bölerek tepki olarak üretilen ATP gerçek miktarı elde etmek. F1Fo tepki olarak kullanılan toplam miktarı bu değere ayarlamak ve sonunda ATP sentezi µmol ATP oranının hızlı / (mg F1Fo* min).