Summary

Fabricação de superfícies de vidro de qualidade óptica para estudar a fusão do macrófago

Published: March 14, 2018
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Summary

Este protocolo descreve a fabricação de superfícies de vidro ótico-qualidade adsorvido com compostos contendo hidrocarbonetos de cadeia longa que podem ser usados para monitorar fusão macrófago de espécimes vivos e permite a microscopia de super-resolução de espécimes fixos .

Abstract

Visualizando a formação de células gigantes multinucleadas (MGCs) de espécimes vivos tem sido um desafio devido ao fato de que mais técnicas de imagem ao vivo requerem a propagação da luz através do vidro, mas no vidro fusão macrófago é um evento raro. Este protocolo apresenta a preparação de várias superfícies de vidro de qualidade óptica onde a adsorção de compostos contendo hidrocarbonetos de cadeia longa transforma o vidro em uma superfície de fusogenic. Em primeiro lugar, a preparação de superfícies de vidro limpo como material para a modificação da superfície de partida é descrita. Em segundo lugar, um método é fornecido para a adsorção de compostos contendo hidrocarbonetos de cadeia longa para converter não-fusogenic vidro em um substrato de fusogenic. Em terceiro lugar, este protocolo descreve a fabricação de superfície micropatterns que promovem um elevado grau de controle spatiotemporal sobre formação de MGC. Finalmente, fabricar pratos de vidro inferior é descrito. Exemplos de utilização deste sistema de célula em vitro como um modelo para estudar a fusão do macrófago e MGC formação são mostrados.

Introduction

A formação de MGCs acompanha uma série de estados patológicos, no corpo humano distinto de inflamação crônica1. Apesar do acordo que mononucleadas macrófagos fundem-se para formar MGCs2, surpreendentemente poucos estudos têm mostrado a fusão em contexto com vivos espécimes3,4. Isso ocorre porque as superfícies de vidro limpo que são necessárias para a maioria das técnicas de imagem não promover fusão macrófago quando induzida por citocinas inflamatórias5. Com efeito, se limpa vidro é usado como substrato para a fusão do macrófago, então baixa a objectivos intermédios ampliação (ou seja, 10-20 X) e mais de 15 h de contínua imagens são geralmente necessário para observar um evento único de fusão.

Na outra mão, fusogenic superfícies plásticas (por exemplo, permanox) ou plástico grade bacteriológica promova fusão2. No entanto, imagens através do plástico é problemática, porque o substrato é espesso e dispersa a luz. Isso complica a imagem latente, pois há muito trabalho objectivos de distância (LWD) são necessários. No entanto, objectivos LWD geralmente têm baixa capacidade em comparação com suas contrapartes da lamela-corrigido de captura de luz. Além disso, técnicas que exploram as mudanças na polaridade da luz que passa através da amostra como contraste de interferência diferencial são impossíveis, já que o plástico é birrefringentes. As barreiras associadas ao uso do plástico são ressaltou ainda mais pelo fato de que é impossível prever onde a formação de fusão/MGC macrófago ocorrerá na superfície. Juntos, essas limitações restringem a visualização da fusão do macrófago a óptica de contraste de fase, estendido durações de imagem totais (> 15 horas contínuas) e baixa resolução.

Recentemente, nós identificamos uma superfície de vidro altamente fusogenic durante a realização de microscopia de resolução super single-molécula com macrófagos fixos/MGCs4. Esta observação foi surpreendente porque limpa vidro superfícies promovem fusão à baixíssima taxa de ~ 5% após 24 h na presença de interleucina-4 (IL-4), conforme determinado pela fusão do índice4. Descobrimos que a capacidade de promover fusão era devido à contaminação de oleamide. Adsorção de oleamide ou outros compostos que da mesma forma continham hidrocarbonetos de cadeia longa feita a fusogenic de vidro. A maioria dos compostos fusogenic (parafina) foi micropatterned, e é transmitido a um alto grau de controle spatiotemporal sobre fusão de macrófagos e um aumento de 2 vezes no número de eventos de fusão observado dentro a mesma quantidade de tempo em comparação com permanox. Estas superfícies ópticas-qualidade desde o primeiro vislumbre nas características morfológicas e cinética que regem a formação de MGCs em espécimes vivos.

Neste protocolo, descrevemos a fabricação de uma variedade de superfícies de vidro que pode ser usado para monitorar a formação de MGCs de espécimes vivos. Além disso, mostramos que essas superfícies são receptivos às técnicas de super-resolução consideravelmente-campo. Fabricação de superfície é dependente sobre o objetivo do experimento, e cada superfície é descrito com exemplos relacionados no texto processo.

Protocol

Procedimentos que utilizam animais foram aprovados pelas comissões de utilização na clínica Mayo, Campus de pesquisa Janelia e Arizona State University e cuidado Animal. 1. preparar o ácido-limpa vidro de tampa Nota: tampa vidro comprado de muitos fabricantes podem não ser tão limpo como esperado. Considere-se rotineiramente limpeza lotes de vidro de tampa, antes de qualquer procedimento onde microscopia está envolvida. Comprar vidro de tampa de el…

Representative Results

Parâmetros físico-químicos de materiais tem efeitos dramáticos sobre a extensão do macrófago fusão7,8,9,10. Além disso, contaminantes superficiais são conhecidos por promover o macrófago fusão11. Portanto, é importante começar com limpo vidro de tampa como um controle negativo para fusão de macrófagos. Quando limpo conforme…

Discussion

A necessidade de identificar e desenvolver posteriormente as superfícies de vidro ótico-qualidade que promovem a fusão do macrófago resultou do fato de que até recentemente não publicado estudo diretamente visualizado fusão macrófago no contexto de vida espécimes3, 4. Isto é devido ao fato de que fusogenic as superfícies plásticas que são comumente usadas exigem objectivos LWD e são em grande parte limitadas a óptica de contraste de fase. Estas ba…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer os membros do laboratório de Ugarova e investigadores no centro para Biologia Vascular e metabólica para discussão útil deste trabalho. James Faust deseja expressar sua gratidão aos instrutores no curso de laboratório de Biologia Molecular Europeu Super resolução microscopia em 2015. Desejamos agradecer Satya Khuon no Janelia ajuda com preparação da amostra para LLSM. Durante a revisão e a filmagens porções deste trabalho James Faust foi apoiado por uma bolsa T32 (5T32DK007569-28). O componente de folha de luz da estrutura deste trabalho foi apoiado pelo HHMI e Betty e Gordon Moore Foundation. T.U. é financiado pelo NIH conceder HL63199.

Materials

Plasma cleaner Harrick Plasma PCD-32G
Finder grid Electron microscopy sciences G400F1-Au any gold TEM grid will work
Cover glass (22×22 mm) Thor Labs CG15CH use only high stringency cover glass
Paraffin wax Sigma Aldrich 17310
Petrolatum Sigma Aldrich 16415 must be α-tocopherol-free if substituted
Oleamide Sigma Aldrich O2136 prepare fresh
Isopropanol Sigma Aldrich 278475
Toluene Sigma Aldrich 244511
Acetone VWR International BDH1101
Ethanol Electron microscopy sciences 15050 use low dissolved solids ethanol
Hydrochloric acid Fischer Scientific A144C-212 use to acid wash cover glass
Slyguard 184 VWR International 102092-312 mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h
35 mm petri dish Santa Cruz Biotech sc-351864
Dumont no. 5 forceps Electron microscopy sciences 72705 ideal for removing TEM grid in section 3.5
FBS Atlanta Biological S11550
DMEM:F12 Corning 10-092 contains 15 mM HEPES
Pen/Strept Corning 30-002-Cl
HBSS Corning 21-023
BSA solution Sigma Aldrich A9576 use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages
IL-4 Genscript Z02996 aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C
C57BL/6J Jackson Laboratory 000664 use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents
eGFP-LifeAct mice n/a n/a use for live fluorescence imaging
Kimwipe Kimberly Clark  34155 use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces

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Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Heddleston, J., Chew, T., Lampe, M., Balabiyev, A., Ros, R., Ugarova, T. P. Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion. J. Vis. Exp. (133), e56866, doi:10.3791/56866 (2018).

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