Dit protocol beschrijft de fabricage van optische kwaliteit glazen oppervlakken geadsorbeerde met verbindingen met lange-keten-koolwaterstoffen die kunnen worden gebruikt voor het controleren van macrofaag fusie van levende specimens en super resolutie microscopie van vaste specimens in staat stelt .
Visualiseren van de vorming van multinucleaire reus cellen (MGCs) van levende specimens heeft zijn uitdagend wijten aan het feit dat meest levende imaging technieken voortplanting van het licht door glas vereisen, maar op glas macrofaag fusion een zeldzame gebeurtenis is. Dit protocol stelt de fabricage van verschillende optische kwaliteit glazen oppervlakken waar adsorptie van verbindingen met lange-keten koolwaterstoffen glas transformeert in een fusogenic oppervlak. Voor het eerst, voorbereiding van schone glazen oppervlakken als grondstof voor oppervlakte modificatie is beschreven. Ten tweede, een methode wordt alleen ondersteund voor de adsorptie van verbindingen met lange-keten koolwaterstoffen om te converteren van niet-fusogenic glas naar een fusogenic ondergrond. Ten derde, wordt dit protocol beschreven fabricage van oppervlakte micropatterns ter bevordering van een hoog beschermingsniveau Spatio controle over MGC vorming. Tot slot is het fabriceren van glazen bodem gerechten wordt beschreven. Voorbeelden van gebruik van deze cel in vitro stelsel als een model te bestuderen macrofaag fusion en MGC vorming zijn weergegeven.
De vorming van MGCs begeleidt een aantal pathologische toestanden in het menselijk lichaam gekenmerkt door chronische ontsteking1. Ondanks het akkoord dat macrofagen van mononucleated fuse aan formulier MGCs2, verrassend weinig studies hebben aangetoond fusion in verband met levende specimens3,4. Dit is omdat de macrofaag fusion wanneer geïnduceerd door inflammatoire cytokines5zijn niet bevorderlijk voor schone glazen oppervlakken die vereist voor de meeste beeldvormingstechnieken zijn. Inderdaad, als schoon glas wordt gebruikt als substraat voor macrophage fusion, vervolgens laag tot vergroting van de tussentijdse doelstellingen (dat wil zeggen, 10-20 X) en meer dan 15 uur continue imaging vaak moeten observeren van een enkele fusion-gebeurtenis.
Op de andere hand, fusogenic kunststof oppervlakken (bijvoorbeeld, permanox) of bacteriologische kwaliteit kunststof fusion2te bevorderen. Beeldvorming door middel van kunststof is echter problematisch omdat het substraat dik is en licht verstrooit. Dit compliceert imaging sinds lang werkende afstand (LWD) doelstellingen nodig zijn. LWD doelstellingen hebben echter meestal weinig licht het verzamelen van de capaciteit in vergelijking met hun tegenhanger dekglaasje aan-gecorrigeerd. Verder zijn technieken die gebruik maken van de veranderingen in de polariteit van het passeren van het model zoals differentiële interferentie contrast licht niet onmogelijk omdat kunststof birefringent. De belemmeringen die zijn gekoppeld aan het gebruik van kunststof zijn verder onderstreept door het feit dat het is onmogelijk om te voorspellen waar de macrofaag fusion/MGC vorming zal plaatsvinden op het oppervlak. Samen, deze beperkingen beperken de visualisatie van macrofaag fusie aan fase contrast optica, totale imaging duur verlengd (> 15 ononderbroken uur), en lage resolutie.
We onlangs geïdentificeerd een zeer fusogenic glazen oppervlak terwijl het uitvoeren van single-molecuul super resolutie microscopie met vaste macrofagen/MGCs4. Deze observatie was verrassend omdat schoon glas oppervlakken bevorderen fusion zeer laag debiet van ~ 5% na 24 uur in aanwezigheid van Interleukine-4 (IL-4), zoals bepaald door de fusie index4. We vonden dat de capaciteit ter bevordering van kernfusie te wijten aan oleamide besmetting was. Adsorptie van oleamide of andere verbindingen die ook lange-keten koolwaterstoffen maakte de glazen fusogenic. De meeste fusogenic samengestelde (paraffine) was micropatterned, en het een hoge mate van Spatio beheersing van de macrofaag fusion en een 2-fold stijging van het aantal fusion gebeurtenissen in dezelfde hoeveelheid tijd in vergelijking met permanox waargenomen bijgebracht. Deze optische kwaliteit oppervlakken verschaft de eerste glimp in de morfologische kenmerken en kinetiek die gelden voor de vorming van MGCs in levende specimens.
In dit protocol beschrijven we de fabricage van een verscheidenheid van glazen oppervlakken die kan worden gebruikt voor het controleren van de vorming van MGCs van levende specimens. Bovendien laten we zien dat deze oppervlakken vatbaar voor ver-veld super resolutie technieken zijn. Oppervlakte fabricage is afhankelijk van het doel van het experiment, en elk oppervlak met verwante voorbeelden in de tekst van de procedure wordt beschreven.
De noodzaak om te identificeren en vervolgens het ontwikkelen van optische kwaliteit glazen oppervlakken die macrofaag fusion bevorderen vloeide voort uit het feit dat tot onlangs niet gepubliceerde studie direct gevisualiseerd macrofaag fusie in het kader van levende specimens3, 4. Dit is de wijten aan het feit dat fusogenic kunststofoppervlakken, die vaak worden gebruikt LWD doelstellingen vereisen en grotendeels beperkt tot de fase contrast optiek zijn. Deze …
The authors have nothing to disclose.
Wij wensen dank aan leden van het Ugarova laboratorium en onderzoekers in het midden voor Metabolic en vasculaire biologie voor nuttige discussie van dit werk. James Faust wil zijn dank betuigen aan de instructeurs op de Europese moleculaire biologie laboratorium Super resolutie microscopie cursus in 2015. Wij willen bedanken Satya Khuon op Janelia voor hulp bij de bereiding van de monsters voor LLSM. Tijdens de beoordeling en filmen delen van dit werk werd James Faust ondersteund door een T32 Fellowship (5T32DK007569-28). De Lattice licht blad component van dit werk werd gesteund door HHMI en Betty en Gordon Moore Foundation. T.U. wordt gefinancierd door de NIH HL63199 verlenen.
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
Cover glass (22×22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
Acetone | VWR International | BDH1101 | |
Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
HBSS | Corning | 21-023 | |
BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |