Herstellung optischer Qualität Glasflächen, Makrophagen Fusion zu studieren
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von hochwertigem optischen Glasoberflächen adsorbiert mit Verbindungen, die langkettigen Kohlenwasserstoffe, die können verwendet werden, um Makrophagen Verschmelzung von lebenden Exemplaren zu überwachen und ermöglicht Super-Resolution-Mikroskopie von festen Proben .
Abstract
Die Bildung von mehrkernigen Riesenzellen (MGCs) von lebenden Exemplaren zu visualisieren ist eine Herausforderung gewesen, die meisten live bildgebende Verfahren Ausbreitung von Licht durch das Glas erfordern, aber auf Glas Makrophagen Fusion ein seltenes Ereignis ist. Dieses Protokoll stellt die Herstellung von mehreren optischen Qualität Glasflächen wo Adsorption von Verbindungen, die langkettigen Kohlenwasserstoffe Glas verwandelt sich in eine Fusogenic Oberfläche. Vorbereitung der saubere Glasflächen als Ausgangsmaterial für Oberflächenmodifizierung ist erstbeschrieben. Zweitens ist eine Methode für die Adsorption von Verbindungen, die langkettigen Kohlenwasserstoffe zur Umwandlung von nicht-Fusogenic Glas in ein Fusogenic Substrat zur Verfügung gestellt. Drittens beschreibt dieses Protokoll Herstellung der Oberfläche Micropatterns, die ein hohes Maß an räumlich-zeitliche Kontrolle über MGC Bildung zu fördern. Schließlich wird die Herstellung Glasschalen unten beschrieben. Beispiele für die Verwendung dieses Systems in-vitro- Zelle als ein Modell zur Fusion von Makrophagen und MGC Bildung werden angezeigt.
Introduction
Die Bildung von MGCs begleitet eine Reihe von pathologischen Zuständen in den menschlichen Körper durch die chronische Entzündung1. Trotz Einigung, die Mononucleated Makrophagen zu bilden MGCs2vereinen, erstaunlich wenige Studien Fusion in Zusammenhang mit lebenden Exemplaren3,4. Und zwar deshalb, weil saubere Glasflächen, die für die meisten bildgebenden Verfahren nicht Makrophagen Fusion, wenn durch inflammatorische Zytokine5fördern. In der Tat, wenn sauberes Glas als Trägermaterial für Makrophagen Fusion, dann niedrige mittlere Vergrößerung Ziele (z.B. 10-20 X) und mehr als 15 h Dauerbetrieb verwendet wird Bildgebung müssen häufig eine einzelne Fusion Ereignis beobachten.
Auf der anderen Hand, Fusogenic Kunststoff-Oberflächen (z.B. Permanox) oder bakteriologische Qualität Kunststoff fördern Sie Fusion2. Bildgebung durch Kunststoff ist jedoch problematisch, da das Substrat dick ist und streut das Licht. Dies erschwert, imaging, da lange arbeiten Abstand (LWD) Ziele erforderlich sind. LWD-Ziele haben jedoch in der Regel geringe Lichtstärke Kapazität im Vergleich zu ihrem Pendant Deckglas korrigiert. Darüber hinaus sind Techniken, die ausgenutzt werden Änderungen in der Polarität von Licht durch die Probe z. B. differential Interferenz Kontrast unmöglich, da Kunststoff doppelbrechenden ist. Die Barrieren, die verbunden sind mit der Verwendung von Kunststoff sind weiter durch die Tatsache unterstrichen, die es ist unmöglich vorherzusagen, wo die Makrophagen Fusion/MGC Bildung auf der Oberfläche entstehen wird. Zusammen, diese Einschränkungen schränken die Visualisierung von Makrophagen Fusion zur Phase Kontrast Optik, total imaging Dauer verlängert (> 15 Stunden ununterbrochen), und niedriger Auflösung.
Wir identifizierten vor kurzem eine höchst Fusogenic Glasoberfläche während der Durchführung Einzelmolekül-Superresolution Mikroskopie mit Fixed Makrophagen/MGCs4. Diese Beobachtung war überraschend, weil sauberes Glas Oberflächen fördern Fusion mit einer sehr niedrigen Rate von ~ 5 % nach 24 h in Anwesenheit von Interleukin-4 (IL-4) durch die Fusion index4. Wir fanden, dass die Fähigkeit zur Verschmelzung zu fördern durch Oleamide Verschmutzung. Adsorption von Oleamide oder anderen Verbindungen, die ähnlich wie langkettige Kohlenwasserstoffe enthalten gemacht das Glas Fusogenic. Die meisten Fusogenic zusammengesetzten (Paraffinwachs) war Micropatterned, und es vermittelt ein hohes Maß an räumlich-zeitliche Kontrolle über Makrophagen Fusion und eine 2-fache Erhöhung der Zahl der Fusion-Ereignisse, die innerhalb der gleichen Zeitspanne im Vergleich zu Permanox beobachtet. Diese optische Qualität Flächen versehen den ersten Blick in die morphologischen Merkmale und Kinetik, die die Bildung von MGCs in lebende Exemplare zu Regeln.
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer Vielzahl von Glasflächen, die verwendet werden können, um die Bildung von MGCs von lebenden Exemplaren zu überwachen. Darüber hinaus zeigen wir, dass diese Flächen Fernfeld Höchstauflösung Techniken zugänglich sind. Oberfläche Fertigung ist das Ziel des Experiments abhängig, und jede Fläche wird mit entsprechenden Beispielen im Text Verfahren beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Notwendigkeit zu identifizieren und anschließend entwickeln optische Qualität Glasflächen, die Makrophagen Fusion fördern ergab sich aus der Tatsache, die bis vor kurzem nicht veröffentlichte Studie direkt Makrophagen Fusion im Rahmen des Wohnens visualisiert Proben3, 4. Dies ist dass Fusogenic Kunststoff-Oberflächen, die häufig verwendet werden, LWD Ziele erfordern und beschränken sich weitgehend auf Phase Kontrast-Optik. Diese Hindernisse wurden du…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchte Mitglieder der Ugarova Labor und Ermittler in der Mitte für Stoffwechsel- und vaskuläre Biologie für hilfreiche Diskussion dieser Arbeit danken. James Faust möchte seine Dankbarkeit für die Ausbilder an der European Molecular Biology Laboratory Super Auflösung Mikroskopie-Kurs im Jahr 2015 zum Ausdruck zu bringen. Wir wünschen Satya Khuon am Janelia Danke für Hilfe bei der Probenvorbereitung für die LLSM. Während der Überprüfung und Dreharbeiten Teile dieses Werkes wurde James Faust durch ein T32 Fellowship (5T32DK007569-28) unterstützt. Die Gitter Licht Blatt Komponente dieses Werkes wurde von HHMI und Betty und Gordon Moore Foundation unterstützt. NIH finanziert T.U HL63199 zu gewähren.
Materials
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22×22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
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