Количественное измерение γ-Secretase опосредованной амилоида прекурсоров протеина и вырез декольте в платформах Assay репортера Cell-based Люцифераза
Summary
Мы были успешно созданы две зависящие от субстрата γ-secretase анализов. Обе ячейки на основе анализов, представленные здесь предназначены для количественного определения γ-secretase ферментативную деятельность через выход Светлячок Люцифераза репортеров.
Abstract
Мы разработали пару на основе ячеек Репортер ген анализов количественно измерить γ-secretase расщепление различных субстратов. Эта рукопись описывает процедуры, которые могут быть использованы для мониторинга γ-secretase опосредованной расщепления APP-C99 либо насекают, используя систему репортер Люцифераза Gal4 промоутер driven Светлячок. Эти анализы были созданы стабильно совместно transfecting HEK293 клеток с Gal4 приводом Люцифераза Репортер ген и фрагмента Gal4/VP16-тегами C-терминал приложения (APP-C99; CG клетки), или Gal4/VP16-тегами Notch-ΔE (NΔE; НГ клетки). С помощью этих анализов репортер параллельно, мы показали, что ингибитор ErbB2, CL-387,785, преференциально может подавить γ-secretase расщепление APP-C99 в CG клеток, но не NΔE в клетках нг. Дифференциальный ответы, выставлены CG и нг клетками, когда лечение с CL-387,785, представляют предпочтительным характерные для γ-secretase модуляторы, и эти ответы находятся в явном противоречии с Пан-ингибированием γ-secretase, индуцированных DAPT. Наши исследования обеспечивают прямые доказательства того, что в сотовой связи может быть продифференцированным γ-secretase деятельность, направленную на различных подложках. Поэтому эти новые анализы могут быть полезными инструментами в лекарственных препаратов для повышения АД терапии.
Introduction
Олигомерные формы амилоид β (значения) считается основной причиной нейродегенеративные в мозгах пациентов, страдающих от болезни Альцгеймера (AD)1. Пептиды значения производятся поэтапно расщепления белка амилоида прекурсоров (APP), сначала β-secretase, а затем γ-secretase2. В последнее десятилетие терапевтические подходы к лечению AD были сосредоточены на предотвращении производства значения3. Большинство исследований были сосредоточены на увеличение активности α-secretase, который может препятствовать γ-secretase расщепление APP и тем самым уменьшение производства значения, или ингибирование β-и/или γ-secretase деятельности4. К сожалению неселективной ингибирование β – и γ-secretases результатов в неизбежные побочные эффекты, которые из-за вмешательства в функционирование других физиологических субстратов β – и γ-secretase5,6. Что касается γ-secretase ингибиторы недавние исследования сообщили открытие целого ряда химических и генетические модуляторы, которые можно регулировать производство значения пока оказывает незначительное влияние на основные γ-secretase опосредованной обработки паз7 ,8,9,10,11,12, однако, успешной терапии еще не разработана. Таким образом систематическое экраны являются дальнейшие обнаружить роман генетических и химические модификаторы, которые избирательно могут модулировать γ-secretase опосредованной обработки приложения.
Γ-Secretase известно расщеплять более чем 90 различных якорь мембранных белков. Среди этих субстратов-паз, чья деятельность имеет решающее значение для определения судьбы клетки и дифференциация во время развития13. Выборочно модулирует γ-secretase катализированное приложение обработки в отсутствие затрагивающих Notch обработки будет иметь существенно важное значение для минимизации связанных с Notch побочные эффекты ингибиторов γ-secretase, и считается, что эта избирательность является основным фактором, который будет диктовать биологической эффективности потенциальных γ-secretase Модуляторы для хронического лечения AD. Там был ряд arylsulfonamide производные, такие как GSI-953 (begacestat) и BMS-708163 (avagacestat), которые были найдены на выставку мощным и селективного торможения γ-secretase14,15. Предыдущие исследования показали, что дифференциального ингибирование γ-secretase расщепление APP и паз можно наблюдать с помощью количественной основе ELISA пробирного в сочетании с проверкой в естественных условиях с помощью данио рерио16. Кроме того были созданы на основе ячеек пробирного парадигмы для решения потенциальных субстрата избирательность γ-secretase к APP и Notch17,18. С помощью протоколов похож на описанных здесь, мы недавно обнаружили новый класс (D)-leucinamides, который мощно модулировать γ-secretase расщепление APP с Notch щадящие избирательности19. Вместе Эта коллекция исследований обеспечивает доказательства в концепция поддерживает понятие, что субстрат избирательности/доступность γ-secretase может быть предметом химических модуляции и экспериментальной проверки. Однако эти платформы пробирного часто полагаются на относительно низкой пропускной способности отсчетов и трудоемких подходов, которые могут не соответствовать промышленных стандартов для программ обнаружения наркотиков.
Мы недавно созданных на основе ячеек Люцифераза Репортер ген анализов, которые могут количественно определить каталитической активности γ-secretase сторону двух различных субстратов, 99-амино кислоты C-терминал фрагмент приложения (APP-C99) и внеклеточного удалить домен Notch пептида (NΔE). APP-C99 и NΔE широко использовался как прямой субстратов γ-secretase в различных анализов. Для создания однородной и последовательной Люцифераза Репортер ген анализов для расщепления γ-secretase APP-C99 или NΔE, мы получили одну ГЭС производные стабильной клеточная линия (CG), конститутивно выражает Gal4 промоутер driven Светлячок Люцифераза репортер ( Gal4-Luc) и Gal4/VP16-тегами APP-C99 синтез белка (C99-GV). Кроме того мы создали еще один ГЭС производные стабильной клеточная линия (НГ), конститутивно выражает Gal4-люк и Gal4/VP16-меткой NΔE (NΔE-GV). С помощью этих анализов Роман субстрата конкретных γ-secretase, мы теперь предоставляют метод для количественного определения и отличать каталитической активности γ-secretase к различных субстратов (APP-C99 в клетках CG), или NΔE в клетках нг. Кроме того анализы конкретного субстрата γ-secretase были разработаны для способствовать высоким содержанием скрининг платформ. Эти вновь созданные γ-secretase анализов может проложить путь для открытия модуляторы Роман γ-secretase, которые могли бы улучшить когнитивные функции, подавляя значения производства без вызывая нежелательных ингибирование паз для обработки следующего поколения объявления.
Protocol
Representative Results
Discussion
Многообещающие результаты пробу этап 1b иммунотерапии aducanumab для AD твердо установили решающую роль Aβ в патогенезе AD22 и предположить, что анти Aβ подходы по-прежнему жизнеспособной стратегии развития анти ад наркотиков. Здесь мы описываем анализов на основе ячеек для количе?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят основной фонд Институт клеточной и организмический биологии, Синика, за технической поддержкой. Это исследование было поддержано Министерством науки и технологии, Тайвань (наиболее 103-2320-B-001-016-MY3 к ю.-ф. L.), программа для трансляционного инноваций биофармацевтических развития – технология поддержки платформы оси схеме (NP7 к ю.-ф.л.) и Синика (на ю.-ф.л.).
Materials
| VictorLight luminescence plate reader | PerkinElmer | 2030-0010 | |
| Class II, Type 2 Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| CL-387,785 | EMD Calbiochem | 233100-1MG | |
| DAPT | Merck | 565770 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 12100046 | main compnent of growth medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 16000044 | |
| Blasticidin | Thermo Fisher | A1113903 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25005 | |
| Hygromycin B | Gibco | 10687010 | |
| Hemocytomer | Sigma-Aldrich | BR717805 Aldrich | |
| 96-well microplate | Nunc | 156545 | |
| Tetracycline | Sigma | T7660 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Steady-Glo luciferase assay reagent | Promega | E2510 | |
| Humidified CO2 incubator | Revco | Ultima II | |
| T-REx293 cell line | Invitrogen | R71007 | |
| Wallac 1420 software version 3.0 | PerkinElmer | instrument control software of the luminescence microplate reader |
References
- Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).
- Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. APP at a glance. J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).
- Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer’s disease: an appraisal for the development of therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).
- Citron, M. Alzheimer’s disease: strategies for disease modification. Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).
- Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer’s disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential. J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).
- Parks, A. L., Curtis, D. Presenilin diversifies its portfolio. Trends Genet. 23 (3), 140-150 (2007).
- Kukar, T. L., et al. Substrate-targeting gamma-secretase modulators. Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).
- Kounnas, M. Z., et al. Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).
- Thathiah, A., et al. The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons. Science. 323 (5916), 946-951 (2009).
- Flajolet, M., et al. Regulation of Alzheimer’s disease amyloid-beta formation by casein kinase I. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).
- Eisele, Y. S., et al. Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin. Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).
- He, G., et al. Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer’s disease. Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).
- Haapasalo, A., Kovacs, D. M. The many substrates of presenilin/gamma-secretase. J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).
- Gillman, K. W., et al. Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor. ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).
- Hopkins, C. R. ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953). ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).
- Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein. Mol Brain. 1, 15 (2008).
- McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates. J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).
- Basi, G. S., et al. Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer’s disease. Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36 (2010).
- Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators. Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).
- Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway. J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).
- Wang, B. J., et al. ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).
- Sevigny, J., et al. The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer’s disease. Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).
- Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. gamma-Secretase inhibitors and modulators. Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).
- Coric, V., et al. Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial. JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).
- Mitani, Y., et al. Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice. J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).
- Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer’s Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis. J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).
