Mesure quantitative de la protéine précurseur de l’amyloïde véhiculée par γ-sécrétase et Notch clivage dans Cell-based Luciferase Reporter Assay plates-formes

Les formes oligomères de β amyloïde (Aß) sont censés être la cause principale de la neurodégénérescence dans le cerveau des patients souffrant de la maladie d’Alzheimer (ma)¹. Les peptides bêta-amyloïdes sont produites par le clivage progressif de la protéine précurseur de l’amyloïde (APP), tout d’abord par la β-secretase, puis par γ-sécrétase². Au cours de la dernière décennie, des approches thérapeutiques vers un traitement d’AD ont mis l’accent sur la prévention de la production de bêta-amyloïdes³. La majorité des études ont porté sur soit l’augmentation de l’activité α-secretase, ce qui peut empêcher la γ-secretase clivage de l’APP et ainsi diminuer la production de bêta-amyloïdes ou l’inhibition de la β-et/ou γ-sécrétase activités⁴. Malheureusement, l’inhibition non-sélective de β – ou γ-secrétases entraîne des effets secondaires inévitables qui sont en raison de l’interférence avec le fonctionnement d’autres substrats physiologiques de β – et γ-sécrétase^5,6. En ce qui concerne les inhibiteurs de la γ-secretase, des études récentes ont signalé la découverte d’un certain nombre de modulateurs chimiques et génétiques qui peuvent réglementer la production de bêta-amyloïdes tout en exerçant des effets négligeables sur la transformation de γ-sécrétase-mediated essentielle des encoche^{7 ,8,9,10,11,12}, cependant, succès thérapeutiques n’ont pas encore été développé. Ainsi, plus systématiques écrans sont garantis pour découvrir de nouveaux modificateurs génétiques et chimiques qui pourraient moduler sélectivement le traitement d’APP véhiculée par γ-sécrétase.

Γ-sécrétase est connue en conjonction avec plus de 90 différentes protéines ancrées à la membrane. Parmi ces substrats est ordre, dont l’activité est essentielle pour déterminer le destin cellulaire et différenciation au cours du développement,¹³. Modulant sélectivement catalysée par γ-sécrétase APP traitement en l’absence d’affecter le cran traitement seront essentiel pour minimiser Notch-effets secondaires des inhibiteurs de la γ-secretase, et cette sélectivité est considérée comme des principaux facteurs qui seront dicter l’efficacité biologique de modulateurs de γ-sécrétase potentiels pour le traitement chronique de AD. Il y a eu un certain nombre de dérivés arylsulfonamide, tels que GSI-953 (begacestat) et le BMS-708163 (avagacestat), qui ont été affectés présentent une inhibition puissante et sélective de la γ-sécrétase^14,15. Une étude antérieure a montré que l’inhibition différentielle de γ-sécrétase clivage de l’APP et l’encoche peut être observée à l’aide d’un test quantitatif par ELISA en combinaison avec validation en vivo à l’aide de poisson-zèbre,¹⁶. En outre, paradigmes de test basés sur les cellules ont été établis pour traiter la sélectivité de substrat potentiels de la γ-secretase vers APP et Notch^17,18. À l’aide des protocoles similaires à celles décrites dans les présentes, nous avons récemment découvert une nouvelle classe de (D)-leucinamides qui modulent puissamment γ-sécrétase clivage de l’APP avec encoche d’épargne sélectivité¹⁹. Ensemble, ce recueil d’études fournit une preuve de concept soutenant l’idée que la sélectivité/disponibilité des substrats de la γ-secretase peut être soumis à la modulation chimique et vérification expérimentale. Toutefois, ces plates-formes de dosage dépendent souvent relativement faible débit lectures et approches à forte main-d’oeuvre qui pourraient respectent pas les normes industrielles pour les programmes de recherche.

Nous avons généré récemment dosages de gène de journaliste luciférase à base de cellules qui peuvent de déterminer quantitativement l’activité catalytique de la γ-secretase vers deux substrats distincts, le fragment de C-terminal acid amino-99 d’APP (APP-C99) et l’extracellulaire domaine-supprimé un peptide Notch (NΔE). Les APP-C99 et NΔE ont été couramment comme substrats directes de la γ-secretase lors d’essais différents. Pour générer des essais de gène journaliste luciférase homogène et cohérente pour le clivage de la γ-secretase de APP-C99 ou NΔE, nous avons généré une ligne de cellule stables dérivés HEK (CG) qui exprime constitutivement une Gal4 pilotée par le promoteur firefly luciferase reporter ( GAL4-Luc) et la protéine de fusion de Gal4/VP16-tag APP-C99 (C99-GV). En outre, nous avons généré une autre ligne de cellule stables dérivés HEK (NG) qui exprime constitutivement Gal4-Luc et Gal4/VP16-le tag NΔE (NΔE-GV). À l’aide de ces tests de nouveaux substrats spécifiques γ-secretase, nous fournissons maintenant une méthode permettant de quantifier et de distinguer l’activité catalytique de la γ-secretase vers différents substrats (APP-C99 dans les cellules CG), ou NΔE dans les cellules de NG. En outre, les dosages de substrat spécifique γ-sécrétase visaient à être propice aux plates-formes de criblage de haute teneur. Ces tests nouvellement généré γ-sécrétase pourraient ouvrir la voie à la découverte de nouveaux γ-sécrétase modulateurs susceptibles d’améliorer la fonction cognitive de supprimer la production de bêta-amyloïdes sans suscitant indésirable inhibition de cran pour le traitement de la nouvelle génération de AD.