Misurazione quantitativa della proteina precursore dell'amiloide γ-secretasi-mediata e la fenditura di Notch in Cell-based Luciferase Reporter Assay piattaforme
Summary
Abbiamo generato con successo due saggi di substrato specifico γ-secretasi. Entrambi analisi cell-based qui presentate sono progettate per quantificare le attività enzimatiche γ-secretasi tramite l’uscita dei reporter luciferasi firefly.
Abstract
Abbiamo sviluppato un paio di saggi gene reporter basati su celle a misurare quantitativamente γ-secretasico di distinti substrati. Questo manoscritto descrive le procedure che possono essere utilizzate per monitorare γ-secretasi-mediata di clivaggio di APP-C99 o tacca, utilizzando un sistema di Gal4 promotore-driven firefly luciferase reporter. Queste analisi sono state stabilite da stabile co-trasfezione cellule HEK293 con il gene del reporter di luciferase Gal4-driven e frammento C-terminale Gal4/VP16-etichetta dell’APP (APP-C99; Cellule CG), o il Gal4/VP16-etichetta tacca-ΔE (NΔE; Cellule di NG). Usando questi saggi reporter in parallelo, abbiamo dimostrato che un inibitore di ErbB2, CL-387.785, preferenzialmente può sopprimere γ-secretasico di APP-C99 in cellule di CG, ma non NΔE in cellule di NG. Le risposte differenziali hanno esibite dalle cellule del CG e NG, quando trattati con CL-387.785, rappresentano una caratteristica preferita per modulatori di γ-secretasi, e queste risposte sono in netto contrasto con la pan-inibizione di γ-secretasi indotta da DAPT. I nostri studi forniscono la prova diretta che attività di γ-secretasi verso substrati differenti possono essere differenziati in un contesto cellulare. Questi nuovi test può quindi essere strumenti utili nella scoperta della droga per terapie AD migliori.
Introduction
Forme oligomeriche di amiloide-β (Aβ) sono credute per essere la causa primaria della neurodegenerazione nel cervello dei pazienti affetti da morbo di Alzheimer (annuncio)1. Peptidi Aβ sono prodotte tramite la fenditura graduale della proteina precursore dell’amiloide (APP), in primo luogo da β-secretasi e poi da γ-secretasi2. Nell’ultimo decennio, si sono concentrati sulla prevenzione della produzione di Aβ3approcci terapeutici verso trattamento dell’annuncio. La maggior parte degli studi si è concentrati su entrambi l’aumento dell’attività α-secretasi, che può precludere γ-secretasico dell’APP e quindi diminuire la produzione di Aβ, o l’inibizione di β-e/o γ-secretasi attività4. Purtroppo, l’inibizione non selettiva di β – o γ-secretasi provoca inevitabili effetti collaterali che sono a causa di interferenze con il funzionamento di altri substrati fisiologici di β – e γ-secretasi5,6. Per quanto riguarda gli inibitori di γ-secretasi, studi recenti hanno riferito la scoperta di un numero di modulatori chimici e genetici che possono regolare la produzione di Aβ pur esercitando effetti trascurabili sul trattamento essenziale di γ-secretasi-mediata della tacca7 ,8,9,10,11,12, tuttavia, terapeutica di successo non sono state ancora sviluppate. Così, ulteriori schermi sistematici sono autorizzati a scoprire romanzo modificatori genetici e chimici che possono modulare selettivamente γ-secretasi-mediata del processamento di APP.
Γ-secretasi sono conosciuto per più di 90 diverse proteine ancorata alla membrana. Tra questi substrati è tacca, la cui attività è fondamentale per la determinazione di destino delle cellule e differenziazione durante lo sviluppo13. Selettivamente modulando APP γ-secretasi-catalizzata di elaborazione in assenza di pregiudicare la tacca elaborazione sarà essenziale per minimizzare effetti collaterali correlati al tacca di γ-secretasi inibitori, e questa selettività è pensata per essere un fattore primario che verrà dettare l’efficacia biologica di potenziali modulatori di γ-secretasi per il trattamento cronico dell’annuncio. Ci sono stati un certo numero di derivati arylsulfonamide, come GSI-953 (begacestat) e BMS-708163 (avagacestat), che sono stati trovati per esibire l’inibizione potente e selettivo di γ-secretasi14,15. Uno studio precedente ha dimostrato che l’inibizione differenziale di γ-secretasico di APP e tacca può essere osservato utilizzando un test ELISA quantitativo in combinazione con la convalida in vivo utilizzando zebrafish16. Inoltre, paradigmi di analisi basati su cellule sono state stabilite per affrontare il potenziale selettività di substrato di γ-secretasi verso APP e tacca17,18. Utilizzando protocolli simili a quelle descritte nel presente documento, abbiamo recentemente scoperto una nuova classe di (D)-leucinamides che modulano potentemente γ-secretasico di APP con tacca-con parsimonia selettività19. Insieme, questa raccolta di studi fornisce un proof-of-concept sostiene la nozione che la selettività/disponibilità del substrato di γ-secretasi possono essere soggetti a verifiche sperimentali e modulazione chimica. Tuttavia, queste piattaforme di analisi spesso si basano su letture relativamente bassa produttività e laboriosi approcci che potrebbero non soddisfare gli standard industriali per programmi di scoperta della droga.
Recentemente abbiamo generato le analisi di gene reporter luciferasi basati su cellule che possono determinare quantitativamente l’attività catalitica di γ-secretasi verso due distinti substrati, il frammento C-terminale acido 99-amminico dell’APP (APP-C99) ed extracellulare dominio-eliminato peptide tacca (NΔE). Sia APP-C99 e NΔE sono stati ampiamente utilizzati come substrati diretti di γ-secretasi in vari saggi. Per generare analisi di gene reporter luciferasi omogenea e coerente per il γ-secretasico di APP-C99 o NΔE, abbiamo generato una linea cellulare stabile HEK-derivata (CG) che esprime costitutivamente un Gal4 promotore-driven firefly luciferase reporter ( Gal4-Luc) e proteina di fusione Gal4/VP16-taggati APP-C99 (C99-GV). Inoltre, abbiamo generato un’altra linea cellulare stabile HEK-derivata (NG) che esprime costitutivamente Gal4-Luc e Gal4/VP16-etichetta NΔE (NΔE-GV). Utilizzando queste analisi romanzo substrato specifico γ-secretasi, ora forniamo un metodo per quantificare e distinguere l’attività catalitica di γ-secretasi verso distinti substrati (APP-C99 in cellule di CG), o NΔE in cellule di NG. Inoltre, i saggi di substrato specifico γ-secretasi sono stati progettati per essere favorevole alla piattaforme di screening ad alto contenuto. Queste analisi appena generato γ-secretasi potrebbero spianare la strada per la scoperta dei modulatori di romanzo γ-secretasi che potrebbe migliorare la funzione conoscitiva sopprimendo la produzione di Aβ senza provocare indesiderato inibizione di tacca per il trattamento di nuova generazione dell’annuncio.
Protocol
Representative Results
Discussion
I promettenti risultati da uno studio di fase 1b di immunoterapia aducanumab per annuncio hanno stabilito saldamente il ruolo critico di Aβ nella patogenesi dell’AD22 e suggeriscono che gli approcci anti-Aβ sono ancora una valida strategia per lo sviluppo di farmaci anti-annuncio. Qui, descriviamo analisi cell-based per quantificare γ-secretasi-catalizzata di proteolisi di APP-C99 e NΔE utilizzando sistemi di firefly luciferase reporter. APP-C99 e NΔE sono i due substrati di γ-secretasi più…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano la struttura di nucleo del Istituto del cellulare e biologia organismica, Academia Sinica, per il supporto tecnico. Questo studio è stato sostenuto dal Ministero della scienza e tecnologia, Taiwan (più 103-2320-B-001-016-MY3 Y.-f. L.), il programma per l’innovazione traslazionale di sviluppo biofarmaceutico – tecnologia che supporta la piattaforma asse regime (NP7 a Y.-F.L.) e Academia Sinica (a Y.-F.L.).
Materials
| VictorLight luminescence plate reader | PerkinElmer | 2030-0010 | |
| Class II, Type 2 Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| CL-387,785 | EMD Calbiochem | 233100-1MG | |
| DAPT | Merck | 565770 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 12100046 | main compnent of growth medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 16000044 | |
| Blasticidin | Thermo Fisher | A1113903 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25005 | |
| Hygromycin B | Gibco | 10687010 | |
| Hemocytomer | Sigma-Aldrich | BR717805 Aldrich | |
| 96-well microplate | Nunc | 156545 | |
| Tetracycline | Sigma | T7660 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Steady-Glo luciferase assay reagent | Promega | E2510 | |
| Humidified CO2 incubator | Revco | Ultima II | |
| T-REx293 cell line | Invitrogen | R71007 | |
| Wallac 1420 software version 3.0 | PerkinElmer | instrument control software of the luminescence microplate reader |
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