Simultânea distinção de monoespecíficos e DFS70 mistos padrões durante exibição de ANA com um substrato de romance nocaute ELITE/DFS70 HEp-2

Substrato hEp-2 ELITE/DFS70 KO preserva padrões clássicos ANA e facilita a distinção clara do padrão de DFS70: Células convencionais e engenharia em substrato HEp-2 ELITE/DFS70 KO são idênticas, preservando todos os auto-antigénios exceto o p75/LEDGF. O controlo negativo fornecido pelo kit estabelece o sinal fluorescente de linha de base. Controlos positivos para padrões de homogêneos, salpicado, Centrómero, nucleolar e mitocondrial na ELITE de HEp-2 produzem um padrão idêntico aos padrões esperados na convencional substrato HEp-2 IIF (Figura 2A). Esses padrões de referência têm sido descritas em detalhes juntamente com a associação do cada padrão antígeno e doença anteriormente4,29. Uma breve descrição dos padrões observados na Figura 2A são fornecidas na tabela 1. DFS70 padrão na ELITE de HEp-2: Aproximadamente 10% das células em cada bem mostrar um padrão salpicado bem denso (ICAP atribuído a nomenclatura: AC-2) que pode ser observado no núcleo interfásico, e cromatina associada a coloração é vista em núcleos mitóticos (Figura 2B). Sobre um substrato HEp-2 convencional, todas as células terão este padrão quando reagiu com uma amostra positiva DFS70. Os restantes ~ 90% de células HEp-2 têm o gene psip1 codificação o antígeno LEDGF nocauteado e, portanto, não produzirá um sinal ou padrão quando reagiu com um monoespecíficos DFS70 soro positivo (Figura 2B). Se 10% das células HEp-2 tem mais brilhante fluorescência correspondente para o padrão de DFS70 e o resto dos células presentes adicionais padrões (por exemplo, bem malhados ou nucleolar), isso indica a presença de padrões mistos. Uma análise mais aprofundada de tais padrões é essencial para confirmar todas as especificidades de auto-anticorpos que estão presentes, além do padrão de DFS70. Para demonstrar a capacidade do substrato HEp-2 ELITE, um painel de soros amostras foi criado com as diferentes concentrações de DFS70 e ANA positivo controlam soros e testaram em ambos convencional e substratos de ELITE de HEp-2, usando um padrão IIF (Figura 3 do protocolo , Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7). Interpretação de DFS70 monoespecíficos e reacções mistas em substratos ELITE convencionais e HEp-2: Para cada padrão de ANA associada a doença específica (Figura 3 Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7), um monoespecíficos ANA padrão à esquerda a maioria da coluna e um monoespecíficos DFS70 padrão à direita coluna mais podem ser observados. As três colunas no meio representam vários rácios de doença associada e controlos positivos de padrão de DFS70. Os padrões mistos resultantes estão desafiando para discernir sobre convencional substrato HEp-2 (Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7, linha superior). No entanto, com o romance substrato Hep-2 ELITE, na maioria das amostras, a diferença de intensidades entre células não modificadas e engenharia é distinta que não só confirma a presença de auto-anticorpos DFS70 (quando a relação mais brilhante para menos células brilhantes é 1:9), mas também revela um padrão secundário de ANA. No caso de homogêneos-DFS70 ou salpicado-DFS70 reações misturada, é impossível predizer com confiança o padrão correto, que leva para o laboratório que optar por executar um número de ensaios adicionais (figura 1A). No caso do centrómero-DFS70 e DFS70-nucleolar misturado reações, suspeitando DFS70 positividade é muito desafiador (Figura 5, Figura 6). Com reações nucleolar e citoplasmático reticular/AMA, o padrão de DFS70 não é dominante, até que a proporção de soros atinge 50%. Em todos os exemplos, o substrato HEp-2 ELITE pode apresentar o padrão de DFS70 e o padrão secundário subjacente ao longo de uma vasta gama de intensidade os níveis e assim facilita uma interpretação mais precisa de ANA. Para observar de perto os padrões mistos, resultados para várias combinações de 50: 50 de ANA e DFS70 positivo controles foram alargada (Figura 8), para ambos convencional e substratos de ELITE de HEp-2. É incentivado a observar a interfase e coloração mitótica para todos os padrões de ANA, incluindo DFS70 em substratos de HEp-2 para melhorar a interpretação e a exatidão do padrão relatado. No entanto, para os padrões mistos, o padrão diferencial apresentado pela divisão do núcleo de células pode não ser suficiente para facilitar a interpretação exata. Setas vermelhas (Figura 8) indicam os núcleos mitóticos na célula convencional e engenharia. Pode-se observar que misturado DFS70 reações na divisão de células não conformes com o conjunto estabelecido de regras para interpretação da doença associada ANA padrões. Amarelas e azuis setas indicam não modificado e engenharia núcleo de células HEp-2 (KO DFS70), respectivamente. Em todas as combinações (Figura 8), é observada uma diferença de intensidade clara entre a célula sem modificações nucleares coloração (~ 10%) e a cela de engenharia nuclear (~ 90%) padrão o mesmo campo de visão microscópica, que permite a exibição simultânea e confirmação do padrão DFS70. Figura 1: ANA rastreio de algoritmos usando métodos convencionais de HEp-2 e HEp-2 ELITE/DFS70 KO IIF. (A) diagrama esquemático desvenda a deficiência de IIF convencional de HEp-2 em identificar monoespecíficos e mistos padrões positivos de DFS70 na fase de triagem (área sombreada amarela) e a sua incapacidade para governar para fora uma secundária associada a doença ANA padrão que pode escondido por padrão DFS70. Além disso, a geração atual de fase sólida específica DFS70, ensaios de confirmação não são capazes de confirmar a positividade de DFS70 monoespecíficos que leva a testes de confirmação adicional para ANAs. (B) esquema revela as capacidades da ELITE de HEp-2 para a seleção de ANAs, distinção simultânea de monoespecíficos e reacções mistas de DFS70, e eliminando a necessidade de fase sólida DFS70 ensaios de confirmação. Algoritmo usando HEp-2 ELITE significativamente simplifica a ANA triagem e reduz o número necessário de ensaios de confirmação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: padrão clássico ANA e DFS70 em substrato HEp-2 ELITE/DFS70 KO. (A) substrato HEp-2 ELITE/DFS70 KO preserva padrões clássicos de ANA. Clássica reação homogênea e DFS70 reações positivas foram produzidas usando os controles positivos fornecidos pelo kit. Outras reações foram produzidas usando soros de controlo positivo estabelecida anteriormente para salpicados, Centrómero, nucleolar e citoplasmático reticular/AMA reações5. (B) substrato HEp-2 ELITE/DFS70 KO fornece células convencionais e engenharia, que facilita a fácil distinção de padrão de DFS70. Diagrama esquemático mostra a reação de monoespecíficos DFS70 resultante coloração padrão na interfase e a divisão do núcleo de células para convencionais e engenharia (DFS70-KO) células. Engenharia de células HEp-2 são desprovidas de antígeno LEDGF/p75/DFS70 que permite a detecção simultânea de padrões secundários que geralmente ficam escondidas pela reação de auto-anticorpos DFS70 em substratos convencionais de HEp-2. As setas (amarelo) indicam exemplos de núcleos de células mitóticas. Barras de escala representam 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: DFS70 e sera homogênea em combinação. DFS70 monoespecíficos sera foram combinada com um controle padrão homogêneo positivo em várias relações (100:0, 80: 20, 50: 50, 20:80 e 0:100) e testado em substratos de convencional e engenharia (DFS70-KO) HEp-2. Barras de escala representam 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: DFS70 e salpicado sera em combinação. DFS70 monoespecíficos sera foram combinada com um controle positivo padrão salpicado em várias relações (100:0, 80: 20, 50: 50, 20:80 e 0:100) e testado em substratos de convencional e engenharia (DFS70-KO) HEp-2. Barras de escala representam 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: DFS70 e Centrómero sera em combinação. DFS 70 monoespecíficos sera foram combinada com um controlo de padrão centromérico positivo em várias relações (100:0, 80: 20, 50: 50, 20:80 e 0:100) e testado em substratos de convencional e engenharia (DFS70-KO) HEp-2. Barras de escala representam 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: DFS70 e nucleolar sera em combinação. DFS 70 monoespecíficos sera foram combinada com um controle padrão nucleolar positivo em várias relações (100:0, 80: 20, 50: 50, 20:80 e 0:100) e testado em substratos de convencional e engenharia (DFS70-KO) HEp-2. Barras de escala representam 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7: DFS70 e sera de citoplasmático reticular/AMA em combinação. DFS70 monoespecíficos sera foram combinada com um controle positivo padrão mitocondrial em várias relações (100:0, 80: 20, 50: 50, 20:80 e 0:100) e testado em substratos de convencional e engenharia (DFS70-KO) HEp-2. Barras de escala representam 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 8: misturado padrões (proporção de 50: 50) produzidos no convencional e substratos de ELITE de HEp-2. Diferenças entre os dois substratos são reveladas. Setas vermelhas indicam os núcleos mitóticos em células convencionais e engenharia em ambos os substratos. Para estas combinações, o padrão diferencial apresentado pela divisão do núcleo de células convencional substrato HEp-2 não é suficiente para a interpretação exata dos padrões mistos. Pode-se observar que reacções mistas de DFS70 na divisão de células podem perturbar o conjunto estabelecido de regras para interpretação da doença associada ANA padrões. Amarelas e azuis setas indicam não modificado e engenharia núcleo de células HEp-2 (KO DFS70), respectivamente. Resultados obtidos para todas as combinações testaram no substrato engenharia: diferença entre o padrão nuclear interfase pertencentes a intensidade clara não modificado células (~ 10%) e células engenharia (~ 90%) foi observado, que permitiu simultânea a detecção e confirmação do padrão DFS70. Barras de escala representam 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Padrão de ANA Descrição Homogênea O núcleo inteiro fluoresce a uniformemente com um padrão de coloração difuso. Salpicado Discreta, grossa à multa cegueta de fluorescência em todo o núcleo.  Bem malhados e grossos salpicados padrões têm sido descritos. Nucleolar Os nucléolos mancham como vários corpos sólidos ou salpicados dentro do núcleo. Os subtipos têm sido descritos anteriormente. Centrómero Grandes manchas de número finito. Antigénio reativo segrega com cromossomas condensadas nas células em fase de mitose. Citoplasmático reticular/AMA O citoplasma aparece granular com coloração positiva das mitocôndrias. DFS70 Células HEp-2 de •conventional: um padrão salpicado bem denso é observado no núcleo interfásico e cromatina associada coloração é vista em núcleos mitóticos. •Engineered KO DFS70 células: anticorpos Anti-DFS70 produzem coloração negativa Elite de HEp-2 / DFS70 KO tem células convencionais e engenharia (DFS70 KO) na proporção de 1:9 aproximadamente. Células convencionais produzem o típico padrão de DFS70 e células projetadas produzem um padrão negativo quando reagiu com um DFS70 monoespecíficos/isolado reacções positivas. Tabela 1: descrição dos padrões de ANA.