Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate

Kishore S. Malyavantham; Lakshmanan Suresh

doi:10.3791/56722

JoVE Journal > Immunology and Infection

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Immunology and Infection

ההבחנה סימולטני של Monospecific ודפוסי DFS70 מעורב במהלך ההקרנה אנה עם מצע נוקאאוט הרומן של עלית/DFS70 דלקת-2

Published: January 17, 2018

doi:

10.3791/56722

Kishore S. Malyavantham¹, Lakshmanan Suresh¹

¹Research & Development, Immco Diagnostics,A Trinity Biotech Company

Summary

DFS70 עצמיים לחקות דפוסי נוגדן antinuclear הקשורים למחלות נפוצות שהופך לפירוש מדויק מאתגר בעת שימוש קונבנציונאלי סובסטרטים HEp-2. הפרוטוקול מתאר את יתרונות של הרומן מצע HEp-2 מהונדסים HEp קונבנציונלי-2 באנה ההקרנה, הבחנה DFS70 דפוסי בביטחון גבוה גם monospecific וגם מעורבים ANA חיובי מקרים.

Abstract

הפרעות אוטואימוניות מערכתיות רקמת מאופיינים על ידי העברת נוגדנים antinuclear (אנה). למרות יש מספר טכנולוגיות זמינים עבור אנה ההקרנה, immunofluorescence עקיף (IIF) באמצעות המצע (HEp-2) 2 תאים אפיתל האנושי נשאר השיטה העיקרית ומומלצים בגלל הרגישות מעולה. מצעים HEp-2 יכול לזהות מספר רב של תבניות וכתוצאה מכך מ נוגדן עצמי מחייב autoantigens חלבון ו חומצות גרעין שונות מופץ ברחבי גרעין הציטופלסמה מהתאים. המגוון הגדול של monospecific ודפוסי מעורבות הנובע תגובות חיוביות על המצע HEp-2 גם לסבך את פרשנות והדיוק של דיווח. דוגמה ספציפית אחת אשר קיבל תשומת לב מירבית לאחרונה הוא צפוף בסדר מנומר 70 (DFS70) דפוס הנובע עצמיים זה במיוחד לאגד חלבון הנקרא פקטורי גדילה נגזר אפיתל העדשה (LEDGF). חוסר שיוך ברור עם ספציפי אדמנתית מערכתית, שכיחות גבוהה בקרב אוכלוסיות בריאים הפכו לפירוש מדויק של דפוס DFS70 חשובים. הבחנה מדויקת של DFS70 דפוס הקשורים למחלה דפוסי שימוש המצע HEp-2 קונבנציונלי הוא מאתגר. יתר על כן, לעתים קרובות מופע משותף של דפוס DFS70 יחד עם דפוסי הקשורים למחלות כגון הומוגנית, מנומר, מעורבת הומוגנית שטוף דפוסי לסבך את הפרשנות IIF. מטרת מאמר זה היא כדי להדגים שהתועלת של רומן מהונדסים המצע HEp-2 IIF השומרת את כל היתרונות של המצע HEp-2 קונבנציונאלי בבד עם מתן יכולת להבחין DFS70 דפוס בביטחון גבוה בשני המקרים monospecific ודוגמאות מעורב ANA חיובי. המצע החדש הוא עוד מסוגל לחשוף הקשורים למחלה דפוסי אנה בעבר מוסתר על ידי דפוס DFS70.

Introduction

אנס הן סימן היכר של מחלות אוטואימוניות רקמת חיבור בתיווך מערכתית¹. מספר שיטות מועסקים עבור הקרנה ואישור של אנס. טכניקה IIF באמצעות HEp-2 המצע נשאר בשימוש נרחב ביותר, לעתים קרובות מומלצת שיטה לסינון אנס¹^,². למרות ההתקדמות מתודולוגיות assay אבחון מעבדתי כגון אנזים immunosorbent מקושר assay (אליסה), האנזים מתכלה (EIA), חומרים chemiluminescence (CLIA) המבוסס על חרוז מבחני מולטיפלקס, IIF מאת HEp-2 הוא ההקרנה הנפוצות ביותר שיטת בשל התועלת האבחון שלה עלות האפקטיביות¹^,²^,³. הטכנולוגיות הנ ל assay להסתמך על קבוצה מוגבלת של ילידי מטוהרים או autoantigens רקומביננטי בעוד ההכנות טפט תא HEp-2 על בארות שקופיות זכוכית להציג מערך נרחב של autoantigens בצורתם הטבעית, המבוזרים גרעין, הציטופלסמה זה להגיב עם עצמיים sera החולה או פקדים חיובית, וכתוצאה מכך שפע של דפוסי המקושרים עם מחלות אוטואימוניות שונות. הדפוסים הללו מסווגים לתוך הגרעין, cytoplasmic ו mitotic דפוסים המבוססים על המיקום של אנטיגן בתאים. לכל דפוס ואת אנטיגן המשויך/אנטיגנים מצבי מחלה הם טוב מאופיין⁴. ב שיטת IIF, מודגרת סרה החולה ושליטה על בארות שקופיות זכוכית שמציגים תרבות טפט של תאים HEp-2 תוקן כראוי כדי לשמר את שפע של autoantigens בתצורה הטבעי שלהם. עצמיים sera החולה או פקדים חיובי רשאים לאגד autoantigens שהוצגו על ידי HEp-2 תאים על המצע (שקופיות זכוכית טוב) בתקופת הדגירה. פוסט דגירה, נוגדנים לא מאוגדים הם נשטף, נוגדנים מאוגד של המחלקה IgG מזוהים עם fluorescein/fluorescein isothiocyanate (FITC) מצומדת נגד האדם מגיב IgG. לא מאוגד דיווח-המספר המשלים נשטף הרחק, coverslips זכוכית דקה הם רכובים על גבי השקופיות בעזרת אמצעי הרכבה שומרת על התגובות ואסטמה ומקילה על תצפית במיקרוסקופ פלואורסצנטי. תגובות שנצפו תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצויד עם שילוב מסנן המתאימים עירור פליטה שתצורתו נקבעה לפי הכתב המשמש (עבור הכתבת FITC, מיקרוסקופ אבחון בדרך כלל משתמש במסננים עירור במגוון של 467 -498 nm ומגוון פליטה של 513-556 ננומטר). הנוכחות של אנה מומחש פלורסצנטיות ירוק בהיר של מבנים ספציפיים בתאים. בניגוד פלטפורמות assay אוטומטיות, מתודולוגיה IIF מסתמך על תהליך מפרך של טורי דילול של sera וקביעת חזותי חיובי הדפוסים מכתימים המחייב את המשתמש משמעותי מומחיות⁵^,⁶. למרות מגבלות אלו, IIF מאת HEp-2 נשאר הנפוצה ביותר ומומלץ שיטת להקרנה של אנס בזכות מאמציה האחדה לכיוון דפוס פרשנות ובמינוח הקונצנזוס הבינלאומי על אנה ועדת דפוסים (ICAP), מגדיל את הזמינות של פתרונות אוטומציה IIF החלק עיבוד ותוצאה פרשנות³.

בקרב המון דפוסים שאותרו על ידי שיטת HEp-2 IIF, עצמיים מיקוד המוצר ג’ין psip1 (המכונה גם LEDGF/p75/DFS70), זכו ריבית משמעותית בשנים האחרונות עבור מספר סיבות⁴^,⁵ ^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰. DFS70 עצמיים נמצאים ב- titers גבוהה בפקדים בריאה ולאחר מחקרים עד כה הצליחו להדגים אגודה קליניים ברורים לנוכחות של DFS70 עצמיים⁷^,⁸^,⁹ ^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³. שיעור של דיווח תוצאות חיוביות עבור DFS70 עצמיים מצבי מחלה שונים, גדודים בריא מגוונות בין מחקרים⁶^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹⁴ ^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^,²³ ^,²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸. התבנית monospecific DFS70 הוא טוב הבדיל מדוגמת הומוגניות או מנומר אבל פרשנות דפוסי מעורבת הומוגנית מנומר, נוגדנים anti-DFS70 המתרחשים במשותף עם אחרים אנס הוא מאתגר אפילו עבור הקוראים מומחה. הדור הנוכחי של IIF הקרנת DFS70 מעבדתי ספציפי מבחני ושיטות אינם מסוגלים להבדיל monospecific תגובה DFS70 של דפוסים מעורבים (איור 1A, באזור מוצל הצהוב של האלגוריתם). פירוש מוטעה של DFS70 דפוס כמו הומוגנית, מנומר, או דפוס מעורב, או, להיפךועלולות להיות לה השלכות חמורות על הטיפול בחולה. הפרוטוקול הנפוץ הנוכחי הוא כדלקמן: במעבדה קלינית להעסיק מספר בדיקות מאשרות מעבדתי עבור חגי הקשורים למחלה ו/או שיטה immunoadsorption עבור DFS70/LEDGF כאשר פיין צפוף מנומר (AC-2) דפוס חשוד (איור 1A)⁴^,⁵.

המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים התועלת של רומן מהונדסים המצע HEp-2 IIF (נוק אאוט HEp-2 עלית/DFS70 (KO), יכונו בשם HEp-2 עלית) זה יחזיק את כל היתרונות של HEp קונבנציונלי-2 לסינון אנס בזמן בו זמנית הבחנה DFS70 דפוס עם ביטחון עצמי גבוה, הן monospecific והן אנה מעורבות חיובית במקרים (איור 1B, באזור מוצל הצהוב של האלגוריתם)⁵. המצע HEp-2 עלית מורכבת תערובת משוער של יאומתו קונבנציונאלי HEp-2 תאים ותאים מהונדסים ללא LEDGF/p75/DFS70 אנטיגן יחס 1:9⁵. ההליך IIF HEp-2 עלית הוא זהה השיטה המקובלת HEp-2. תצורת ייחודי של המצע HEp-2 עלית לא רק שומרת על כל היתרונות של HEp2 המקובלת אך יכול להבדיל דפוסי תגובה הומוגנית, מנומר, מעורב DFS70 דפוס ההקרנה הראשונית או בדיקה של מדגם (איור 1B )⁵. סרה החולה כדי להיות הגיב על שקופיות עם סובסטרט IIF HEp-2 צריך להיות מדולל 1:40 עם הקרנת דילול או לפי הקריטריון מעבדה בודדים. תגובה ספציפית 1:40 או כייל נוגדנים גבוה נחשב חיובי.

זה מחקר, סרה חיובי הומוגנית, מנומר, צנטרומר, nucleolar, cytoplasmic רשתי/אמה של דפוסים DFS70 המיוצרת איתות חיובי בינונית (יחסית הפקד שלילי ועל שליטה ANA חיובי שסופקו על-ידי ערכת) הקרנה דילול של 1:40 נבחרו כדי לדמות את הדפוסים הספציפיים מונו ומערבבים על מצעים HEp-2 (קונבנציונלי והאליטה HEp-2). 1:40 מדולל סרה חיובי DFS70 מעורבבים עם 1:40 דילולים של אנה הקשורים למחלה בודדים דפוס הפקדים (הומוגנית, מנומר, צנטרומר, nucleolar, או cytoplasmic רשתי-AMA) יחסי שונים (שליטה: DFS70 100:0, 80:20, 50: 50, 20:80, 0:100), מוערך על-קונבנציונאלי HEp-2 עלית סובסטרטים בעקבות הליך IIF המפורטות להלן.

Protocol

הפרוטוקול עוקב אחר הקווים המנחים של ועדת האתיקה מוסדיים מחקרים אנושיים טריניטי הביוטכנולוגיה. 1. מדגם והכנות המצע לאפשר שקיות המכילות מצע שקופיות (זכוכית שקופיות עם בארות 12 בכל שקופית HEp2 או HEp הכוללת-2 + HEp2 קו תא תערובת) equilibrate לטמפרטורת החדר לקבלת ביצועים מיטביים ולמנוע התעבות של לחות על שקופית השטח לפני תוספת של הדגימה. . זה ייקח בערך בין 10-15 דקות. ברגע equilibrated לטמפרטורת החדר, הסר בזהירות את השקופיות המצע בעזרת האצבעות מבלי לגעת בצדדים של המשקה. תווית השקופיות ולמקם אותם בתא דגירה (בטמפרטורת החדר) עם מגבות נייר לחלח במים כדי למנוע התייבשות של שקופיות במהלך הדגירה תרכיב ולדגום.הערה: לא ספציפית מכתים יכול לגרום מבארות יבש; מגבת נייר רטובה בתוך החדר הדגירה מספק לחות ומונע יובש היטב. 2. תוספת של פקדים ודוגמאות לוותר על-50 µL של הפקדים שלילי/חיובי, שילובים של sera חיובי DFS70-אנה כפי שמתואר זה מחקר, או סרום החולה מדגמים לתוך בארות שקופיות בודדות. לוותר על control(s) ודוגמאות לבאר כל בשקופית. למניעת זיהום צולב היטב, להימנע overfilling הבארות. תוך כדי לא overfilling בארות, להבטיח כיסוי מלא של השטח היטב ולהימנע בועות אוויר.הערה: אמצעי האחסון המומלץ הוא µL 50 לפי שלב 2.1. מניחים את המכסה על תא דגירה, דגירה שקופיות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. אם כל אנה נוכח הסרום של המטופל, זה יהיה לאגד התאים היטב כל נוכח זו תקופת הדגירה. לאחר תקופת הדגירה על, הסר את השקופית תא הדגירה. להחזיק את השקופית בסוף tab ו לשטוף בעדינות עם 10 מ”ל באגירה פוספט מלוחים (PBS) שטיפת מאגר המסופק בערכה, באמצעות פיפטה או בתוך מלא PBS במשך 10-15 ס להעביר את השקופית מיד לתוך צנצנת Coplin ועם מאגר שטיפת PBS (שטיפת משרים) למשך 10 דקות חזור התהליך עם כל השקופיות הנותרים.הערה: בעת הצבת מספר שקופיות בתוך צנצנת Coplin, להבטיח כי הצד תא של השקופית לא פנה לשקופית אחרת, התוצאה תהיה פגיעה בתאים דבקה בשקופית זכוכית. 3. תוספת של המספר המשלים פלורסנט הסר הצנצנת Coplin שקופית אחת בלבד בכל פעם. כדי להסיר המאגר שטיפת עודפי PBS השקופית, בעדינות הקש או כתם על השקופית על מגבת הנייר. כל ערכה מסופק עם FITC עם התווית נגד IgG פלורסנט המספר המשלים. על כל טוב, בעדינות להחיל 1 טיפת (כ-50 µL) המספר המשלים שסופקו. דגירה השקופיות בחדר דגירה מכתימים סגור למשך 30 דקות.הערה: מומלץ השימוש של Fc-IgG ספציפי המספר המשלים. אם כל אנה נוכח הסרום של המטופל, לחשב את המשלים שלו יהיה לאגד התאים נוכח כל טוב במהלך תקופת דגירה אשר התוצאות זריחה ספציפי של תאי נוכח הבארות. לחשב את המשלים שלו הוא רגיש לאור. תא סגור הדגירה יעזור למנוע הפרעות קלות עם תרכיב התגובה של התאים הנמצאים בכל טוב. לאחר תקופת הדגירה על, הסר את השקופית תא הדגירה. להחזיק את השקופית בסוף tab ולשטוף בעדינות עם 10 מ”ל PBS שטיפת המאגר שסופק בערכה, באמצעות פיפטה או גביע מלא עם PBS. להעביר את השקופית מיד לתוך צנצנת Coplin עם מסיר כתמים PBS שטיפת מאגר (להשרות) במשך 10 דקות חזור על התהליך עם כל שאר השקופיות.הערה: בעת הצבת מספר שקופיות בתוך צנצנת Coplin, להבטיח כי הצד תא של השקופית לא פנה לשקופית אחרת, התוצאה תהיה פגיעה בתאים דבקה בשקופית זכוכית. מקם את coverslips המסופקים בערכה של מגבת נייר יבש. התקשורת הרכבה מסופק עם הקיט. על הקצה התחתון של coverslip, החל בין 3-4 טיפות של אמצעי התקשורת הרכבה קו. להוציא שקופית אחת בכל פעם מצנצנת Coplin המכיל מאגר לשטוף. כדי להסיר את המאגר שטיפת עודפי, בעדינות הקש או כתם על השקופית על מגבת הנייר. להוריד את השקופית בעדינות על coverslip על-ידי הצבת בקצה התחתון של השקופית לקצה coverslip. זה מאפשר התקשורת הרכבה הנוכחי על coverslip הקצה התחתון לזרום על הקצה העליון של השקופית, ממזער היווצרות בועות אוויר, אשר עלולים להפריע הקריאה של כל הטוב של שקופית.הערה: לחץ מינימלי צריך לשמש כדי לטעון את השקופית כיסוי על השקופית. לחץ עודף יכול לגרום לרוחב תנועת שער גולשת. זה יכול לגרום נזק הכנת טפט של תאים תוצאה עיוות. לאחסן את השקופיות בחושך ב 2-8 ° c לבחון את השקופיות ברגע שהם מותקנים או בתוך 48 שעות.הערה: אחסון ארוך עלול לגרום הידרדרות של דפוס, אות ניאון. 4. זיהוי של תוצאות חיוביות ושליליות הצגת השקופיות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות ערכת מסנן FITC, הממוקם בחדר חשוך. בדוק עבור ספציפיים פלורסצנטיות ירוק בהיר תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות בהגדלה גדולה של 200 X או יותר, כדי להפוך את הפירוש הסופי לגבי הגישה החיובית ותבנית. לבחון את הפקדים חיוביים ושליליים.הערה: הפקד חיובי יציג פלורסצנטיות ירוק בהיר בגרעין (איור 2 א, Homogeneous). הפקד שלילי יציג אין קרינה פלואורסצנטית ירוק מסוים תחת מיקרוסקופ זריחה. להקליט את התוצאה חיובי/שלילי במשך כל ולכלול את התבנית ANA חיובי במקרים.

Representative Results

. הפ-איי-2 עלית/DFS70 קו המצע משמר דפוסי אנה קלאסי ואסטמה ומקילה על אבחנה ברורה של דפוס DFS70: תאים מהונדסים קונבנציונאלי על המצע HEp-2 עלית/DFS70 קו זהים, שמירה על כל autoantigens חוץ LEDGF/p75. הפקד שלילי שסופקו על-ידי ערכת מבססת את האות ניאון בסיסית. פקדים חיובי אחר דפוסים nucleolar ולאחר מיטוכונדריאלי הומוגנית, מנומר, צנטרומר, עלית HEp-2 לייצר תבנית זהה לתבניות הצפוי ב- IIF HEp-2 קונבנציונאלי המצע (איור 2 א). הדפוסים הללו התייחסות שתוארו בפירוט יחד עם האגודה אנטיגן ומחלות לכל דפוס בעבר4,29. תיאור קצר של דפוסים שנצפו איור 2 א הינם מסופקים בכל טבלה 1. דפוס DFS70 על עלית HEp-2: כ- 10% של תאים בכל טוב מראים דפוס מנומר בסדר צפוף (ICAP שהוקצו נומנקלטורה: AC-2) זה יכול להיות שנצפו על גרעין לאטמוספרה, כרומטין הקשורים מכתים מאוזכרת mitotic גרעינים (איור 2B). על מצע HEp-2 המקובלת, כל התאים יהיה דפוס זה כאשר הגיבו דגימה חיובית DFS70. ~ 90% הנותרים של תאים HEp-2 יש את הגן psip1 קידוד אנטיגן LEDGF בנוקאאוט, לכן לא יפיק את האות או תבנית כאשר הגיבו monospecific הסרום חיובי DFS70 (איור 2B). אם 10% של תאים HEp-2 יש קרינה פלואורסצנטית בהיר התואם תבנית DFS70 ואת שאר התאים נוכח נוספים הדפוסים (למשל, קנס מנומר או nucleolar), אז זה מעיד על קיומם של דפוסים מעורבים. לאחר בדיקה יסודית של תבניות כאלה חיוני לאשר כל specificities נוגדן עצמי כי קיימים בנוסף התבנית DFS70. להפגין את היכולת של המצע HEp-2 עלית, פאנל של sera דגימות נוצר עם ריכוזים שונים של DFS70, ANA חיובי לשלוט סרה ונבדק על שניהם קונבנציונאלי, מצעים HEp-2 עלית באמצעות IIF סטנדרטי של פרוטוקול (איור 3 , איור 4, איור 5, 6 איור, איור 7). פרשנות של DFS70 Monospecific ותגובות מעורבות על מצעים העילית קונבנציונאלי דלקת-2: עבור כל מחלה-הקשורים אנה לתבנית ספציפית (איור 3, איור 4, איור 5, 6 איור, איור 7), monospecific אנה דפוס משמאל לעמודה רוב ותבנית monospecific DFS70 מימין לעמודה רוב ניתן לצפות. שלושת העמודים באמצע מייצגים שונים שונים הקשורים למחלות ופקדים DFS70 דפוס חיובי. מעורבות הדפוסים המתגבשים הם מאתגרים להבחין על-קונבנציונאלי המצע HEp-2 (איור 3, איור 4, איור 5, 6 איור, איור 7, השורה העליונה). עם המצע Hep-2 עלית הרומן, ברוב הדוגמאות, ההבדל בין תאים מהונדסים שלא שונתה עוצמות זאת, ברורים אשר לא רק מאשרת את הנוכחות של DFS70 עצמיים (כאשר היחס בין בהיר יותר לתאים המוארים פחות 1:9) אבל גם מגלה דפוס אנה משנית. במקרה של הומוגניות-DFS70 או מנומר-DFS70 מעורב תגובות, זה בלתי אפשרי לחזות בביטחון את התבנית הנכונה שמובילה המעבדות בוחרים לרוץ מספר מבחני נוספים (איור 1 א’). במקרה של צנטרומר-DFS70 ו- nucleolar-DFS70 מעורבים התגובות, לחשוד חיוביות DFS70 הוא מאוד מאתגר (איור 5, איור 6). עם תגובות nucleolar, cytoplasmic רשתי/אמה, התבנית DFS70 אינה דומיננטית עד היחס סרה מגיעה ל-50%. בדוגמאות כל, המצע HEp-2 עלית יכול להציג את התבנית DFS70 ועל התבנית משני הבסיסית על מגוון רחב יותר של עוצמת הרמות ובכך מקלה על פרשנות אנה מדויקת יותר. להתבונן מקרוב את דפוסי המעורבות, תוצאות שילובים שונים של 50: 50 של אנה, DFS70 חיובי פקדים היו מוגדלת (איור 8) עבור שניהם קונבנציונאלי ותערובות HEp-2 עלית. זה מומלץ להתבונן לאטמוספרה והן מכתים mitotic עבור כל דפוסי אנה כולל DFS70 על מצעים HEp-2 כדי לשפר פרשנות והדיוק של התבנית המדווחת. עם זאת, אחר דפוסים מעורבים, התבנית דיפרנציאלית שהוצגו על-ידי חלוקת גרעין התא עשוי לא יספיק להקל על פירוש מדויק. חצים אדומים (איור 8) להצביע על גרעינים mitotic בתא קונבנציונלי והן מהונדסים. זה יכול להיות שנצפו זה מעורב DFS70 תגובות על חלוקת תאים שאינם מצייתים הוקמה קבוצת הכללים לפרשנויות של המחלה-הקשורים אנה דפוסים. צהוב וכחול חיצים מציינים שלא שונתה, הנדסה (קו DFS70) HEp-2 תא גרעינים, בהתאמה. ב כל השילובים (איור 8), נצפית הבדל ברור אינטנסיביות בין תא יאומתו גרעיני מכתימים (~ 10%) לבין דפוס (~ 90%) גרעיני תאים מהונדסים באותו מיקרוסקופית שדה הראייה, המאפשר הקרנה בו זמנית, אישור של דפוס DFS70. איור 1: אנה הקרנת אלגוריתמים בשיטות הקונבנציונלית HEp-2 ו- HEp-2 עלית/DFS70 קו IIF. (א) מפרטים טכניים פורמת את מחסור של IIF HEp-2 המקובלת לזיהוי monospecific ודפוסי מעורבות DFS70 חיובי בשלב הסינון (אזור מוצל צהוב) ואת יכולתו לשלול כמה נפגעים הקשורים למחלה אנה דפוס זה ייתכן להיות מוסתר על ידי דפוס DFS70. עוד יותר, הדור הנוכחי של DFS70 ספציפיים מעבדתי מבחני מאשרות אינם מסוגלים לאשר את הגישה החיובית DFS70 monospecific, מה שמוביל בדיקות מאשרות נוספות עבור חגי. מפרטים טכניים (B) מגלה את היכולות של עלית HEp-2 להקרנה של אנס, ההבחנה סימולטני של monospecific ו DFS70 תגובות מעורבות, ביטול הצורך מעבדתי DFS70 מבחני אישור. אלגוריתם באמצעות HEp-2 עלית באופן משמעותי מפשט את אנה הקרנת ומפחית את המספר הנדרש של מבחני אישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2: דפוס קלאסי אנה, DFS70 על המצע HEp-2 קו עלית/DFS70. (א) המצע HEp-2 עלית/DFS70 קו משמר דפוסי אנה קלאסי. התגובה הומוגנית קלאסי ותגובות חיוביות DFS70 הופקו באמצעות הפקדים חיובי שסופקו על-ידי ערכת. תגובות אחרות הופקו באמצעות בקרה חיובית שנקבעו קודם sera עבור מנומר, צנטרומר, תגובות nucleolar, cytoplasmic רשתי/אמה5. (B) המצע HEp-2 עלית/DFS70 קו מספק קונבנציונלי והן מהונדסים תאים, אשר מקל על ההבחנה קל של דפוס DFS70. מפרטים טכניים מציג התגובה monospecific הנוצרת DFS70 מכתים דפוס על לאטמוספרה ואת חלוקת גרעין התא עבור תאים (DFS70-KO) קונבנציונלי והן מהונדסים. הנדסה HEp-2 תאים נטולי אנטיגן LEDGF/p75/DFS70 אשר מאפשרת זיהוי דפוסי המשני, בדרך כלל נעלמות DFS70 התגובה נוגדן עצמי על-קונבנציונאלי סובסטרטים HEp-2 בו זמנית. חיצים (צהוב) מציינים דוגמאות תא mitotic גרעינים. סולם העמודות מייצגות 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3: DFS70 וסרה הומוגני בשילוב. DFS70 monospecific סרה בשילוב עם פקד דפוס הומוגני חיובית יחסי שונים (100:0, 80:20, 50: 50, 20:80 ו 0:100), נבדק על מצעים (DFS70-KO) HEp-2 מהונדסים קונבנציונאלי. סולם העמודות מייצגות 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 4: DFS70 ומנומר סרה בשילוב. DFS70 monospecific סרה בשילוב עם פקד דפוס מנומר חיובי ביחסי שונים (100:0, 80:20, 50: 50, 20:80 ו 0:100), נבדק על מצעים (DFS70-KO) HEp-2 מהונדסים קונבנציונאלי. סולם העמודות מייצגות 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 5: סרה DFS70, צנטרומר בשילוב. DFS 70 monospecific סרה בשילוב עם פקד דפוס חיובי צנטרומר יחסי שונים (100:0, 80:20, 50: 50, 20:80 ו 0:100), נבדק על מצעים (DFS70-KO) HEp-2 מהונדסים קונבנציונאלי. סולם העמודות מייצגות 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 6: DFS70 ו- nucleolar סרה בשילוב. DFS 70 monospecific סרה בשילוב עם פקד דפוס nucleolar חיובי ביחסי שונים (100:0, 80:20, 50: 50, 20:80 ו 0:100), נבדק על מצעים (DFS70-KO) HEp-2 מהונדסים קונבנציונאלי. סולם העמודות מייצגות 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 7: DFS70, סרה cytoplasmic רשתי/ינוהל בשילוב. DFS70 monospecific סרה בשילוב עם פקד דפוס מיטוכונדריאלי חיובי ביחסי שונים (100:0, 80:20, 50: 50, 20:80 ו 0:100), נבדק על מצעים (DFS70-KO) HEp-2 מהונדסים קונבנציונאלי. סולם העמודות מייצגות 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 8: מעורב דפוסים (יחס 50: 50) המיוצר על-קונבנציונאלי ותערובות HEp-2 עלית. ההבדלים בין סובסטרטים שני מתגלים. חצים אדומים מציינים גרעינים mitotic בתאים קונבנציונלי והן מהונדסים על שני סובסטרטים. עבור אלה שילובים, התבנית דיפרנציאלית שהוצגו על ידי חלוקת התא גרעינים על-קונבנציונאלי המצע HEp-2 אינה מספיקה לפירוש מדויק של דפוסי המעורבות. זה יכול להיות שנצפו כי תגובות מעורבות DFS70 על חלוקת תאים יכולים perturb הוקמה קבוצת הכללים לפרשנויות של המחלה-הקשורים אנה דפוסים. צהוב וכחול חיצים מציינים שלא שונתה, הנדסה (קו DFS70) HEp-2 תא גרעינים, בהתאמה. התוצאות המתקבלות עבור כל הצירופים נבדק על המצע מהונדסים: הבדל ברור אינטנסיביות בין התבנית גרעיני לאטמוספרה השייכים יבוצעו בהם שינויים-תאים (~ 10%) של תאים מהונדסים (~ 90%) נצפתה, שאיפשר בו זמנית זיהוי ואישור של דפוס DFS70. סולם העמודות מייצגות 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. אנה דפוס תיאור הומוגניות הגרעין כולו שזוהר אחיד עם דפוס מכתימים ‘ מאטום לשקוף ‘. מנומר דיסקרטית, גס משובח ספאקלס של לזרוח ברחבי לגרעין. דפוסי מנומר בסדר מנומר, גס תוארו. Nucleolar Nucleoli כתם גופות מוצק או מוכתם מרובות בתוך הגרעין. תתי סוגים שתוארו קודם לכן. צנטרומר ספאקלס גדול למספר סופי. תגובתי אנטיגן segregates עם מרוכז הכרומוזומים בתאים שעברו מיטוזה. Cytoplasmic רשתי/אמה הציטופלסמה מופיע פרטנית עם צביעה חיובית של המיטוכונדריה. DFS70 •Conventional HEp-2 תאים: דפוס מנומר בסדר צפופה נצפית על גרעין לאטמוספרה ועל כרומטין הקשורים מכתים מאוזכרת mitotic גרעינים. •Engineered DFS70 קו תאים: נוגדנים Anti-DFS70 מייצרים מכתים שלילי עלית HEp-2 / DFS70 קו יש מהונדסים קונבנציונאלי (קו DFS70) תאים כ יחס 1:9. קונבנציונלי מפרישים דפוס DFS70 טיפוסי ומפיקים תאים מהונדסים דפוס שלילי כאשר הגיבו DFS70 monospecific/מבודדים חיובי תגובות. טבלה 1: תיאור דפוסי אנה.

Discussion

עצמיים כדי אנטיגנים גרעינית, cytoplasmic נפוצים מאוד מחלות אוטואימוניות מערכתיות. אמנם אין assay יחיד מספקת את הטוב ביותר האפשרי רגישות וספציפיות, IIF מאת HEp-2 הוא נחשב כשיטה ההקרנה מאוד רגיש וחסכונית עבור מחלות אוטואימוניות מערכתיות-²^,–³^,–⁴ . למרות השכיחות של פרוטוקול IIF עבור יותר מ-50 שנה, הדיוק של IIF assay תלויה מאוד המיומנות של הטכנאי, ביצוע זהיר של השלבים בודדים של פרוטוקול והפירוש מדויק של תוצאות באמצעות מתוחזקים היטב קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. אבחון של מחלה אוטואימונית מערכתית צריך לא להיות מבוסס על תוצאות בדיקה סרולוגית יחיד כגון IIF מאת HEp-2.

שיחזור של ריאגנטים איכותי של מים (מזוקקים/יונים), שימוש למרכיבי הקיט מתוקנן (שקופיות עם HEp-2 תא monolayers, מדגם diluent, פקדים חיוביים ושליליים, מראש מדולל ממוטב FITC-המספר המשלים הרכבה בינונית) יש השפעה חיובית על התוצאות. דילוג על התוספת של פקדים או דוגמאות על וולס יכול לעודד פרשנויות שלילי כוזב. ייבוש של שקופיות בשלב כלשהו לאחר התוספת של מדגם, או שליטה יכול לגרום מלאכותית תגובות חיובי כוזב ו/או דפוסים פסולים. מאגר לשטוף יותר מדי שמאלה בשקופית או ייבוש של שקופיות בארות לפני היתר של הרכבה בינונית עלולה להביא חפצים. הוספת כמות מספיקה של הרכבה בינונית או יצירת בועות על פני שקופיות לפני הנחת coverslip של יכול לגרום תגובות נראות מטושטשות או מחוץ לפוקוס כאשר ציין מתחת למיקרוסקופ. השקופית הממוסגרת חייב להיות מאוחסן ב- 2-8 ° C וניתח בתוך חלון המומלצת של זמן כדי למזער את תוצאות שליליות או מלאכותית שווא.

באמצעות מיקרוסקופ epi-פלורסנט מתוחזקים היטב, אשר הבתים מקור אור LED/Hg/קסנון המתאים, רכיבים אופטיים נקי כולל עירור ומסננים פליטה פגומות לא חיוני להשגת תוצאות מדויקות IIF. משתמש הקצה להכשרת עוצמות תגובה חיובי/שלילי מפלה ופרשנות של דפוסי היא קריטית. IIF HEp-2 מבחני פגיעים חוסר התקינה נהלים, בתצורת מיקרוסקופ, ועל הדרכה למשתמש הקצה או מיומנות. קונצנזוס במינוח ונציג דפוסים ודוגמאות של תמונות רכשה באמצעות יצרנים שונים לזמינים ICAP () לצרכים חינוכיים⁴. HEp-2 תא דפוס סיווג עץ הניתנים על ידי ICAP לחידושים שונים גרעינית, cytoplasmic ו mitotic הוא משאב יקר-ערך ללמוד ההבדלים העדינים דפוסים שונים זה עשוי להיראות דומה העיניים מאומנת⁴. אחת הדוגמאות העיקרי של דפוס מאתגר DFS70 אשר חסרה גם אגודה ברורים עם תנאי אוטואימונית, כמתואר בסעיפים הקודמים תבנית זו נפוצה מאוד אוכלוסיית⁵.

בהתאם המחקר, השכיחות של אנטי-DFS70 עצמיים משתנות בין גדודים בריא, אנה אוכלוסיות ההקרנה, ויחידים ANA חיובי ללא עדות למחלה אוטואימונית מערכתית⁹^,¹⁶^,²⁰³⁰^, ^,³¹. DFS70 עצמיים דווחו להתרחש בבידוד, כמו גם עם אחרים דפוסי אנה הקשורים למחלה. מבודדים או דפוס monospecific DFS70 הוא דיווח ב- 2-22% של פקדים בריא אך פחות מ 1% של המקרים עם מחלות אוטואימוניות ראומטיים³². בהתבסס על מגמות אלה, DFS70 מונו-חיוביות דפוס הוצע כקריטריון לשלול מחלות אוטואימוניות ראומטיים מאת ICAP הוועדה³^,³¹^,³². ועדת ICAP, הוקמה כדי לקדם משלים של נוגדן עצמי מבחן במינוח של פרשנות של תוצאות HEp-2 IIF, ממליצה דיווח DFS70 חיוביות תוך דיווח אנה הקרנת תוצאות⁴.

לפני פסק-הדין החוצה מחלה אוטואימונית מערכתית המבוססת על הגישה החיובית-DFS70 מונו, זה חיוני כדי לסקור את המצב של שיטות ההקרנה ואישור הנוכחי (במיוחד אלה ספציפי עבור DFS70). הסכם בין חיוביות על ידי IIF HEp-2 ומבחני מאשרות מעבדתי כלומר אליסה DFS70, CLIA, קו נקודה/מתכלה חשופה שיטות) מגוונות בין שונים מחקרים¹³^,²²^,²⁵^,³³. פרשנות IIF ואת וזמינותו מאשרות פרמטרים שתורמים למחלוקת זו כבר דנו בעבר⁵^,¹³^,³⁴. בגישה immunoadsorption לאחרונה המוצעת לאישור נוגדן anti-DFS70 כתובות חלק מן הליקויים של מבחני מעבדתי הנוכחי (עבור DFS70) אך דורש המעבדות לבצע צעד נוסף בהליך IIF על דגימות חשד, אשר מגביר את עלות וזמן טיפול לדיווח תוצאות¹³. שלב נוסף זה אינו נדרש כאשר תאים HEp-2 עלית/DFS70 קו משמשים להקרנה השגרה אנה. זה מקטין את העלות הכוללת, בנוסף ויש אין השפעה על משך העבודה כפי DFS70 דפוס הוא הבחין ב ההקרנה הראשונית שלב²⁷. חסרון נוסף בשיטה הקונבנציונלית IIF HEp-2 היא שזה לא מסוגל להבחין DFS70 דפוס שיתוף המתרחשים עם השני אנה דפוסים בשלב ההקרנה. עם זאת, התגברות על החיסרון הזה על ידי שימוש בתאים HEp-2 עלית/DFS70 קו²⁷.

הערכה השוואתית של HEp קונבנציונלי-2 ו החדש מהונדס HEp-2 (HEp-2 KO עלית/DFS70) באמצעות פקדי ANA חיובי ושילובים שלהם עם פקד DFS70 מונו-חיובית, להדגים את התועלת של היכולת המצע החדש של בו זמנית המסך עבור חגי ואשר DFS70 דפוס (איור 1). פרוטוקול IIF עבור המצע החדש הוא זהה השיטה המקובלת HEp-2 IIF. שיטת פרשנות כל מחלות הקשורות דפוסי אנה היא זהה למעט התבנית DFS70 (טבלה 1). פרשנות של דפוסי DFS70 מונו-חיוביות והן מעורב היה יחסית קל בשיטה החדשה ומתחייב זה לא מבחני נוספים (איור 1B). יישום של שיטה חדשה במעבדה קלינית מפשט את האתגר הקשורים עם הפרשנות של דפוס DFS70, משפר את הדיוק הכללי של ANA הקרנה על ידי חשיפת נוספים הקשורים במחלה אנה דפוסים בעבר מוסתר על ידי DFS70 (מעורב תבניות).

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים אנדרו Zenger על ביצוע הניסויים IIF ואיסוף תמונות.

Materials

HEp-2 ELITE / DFS70-KO 12 Well Slide sealed individually in pouch	Trinity Biotech	part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240
ANA positive control	Trinity Biotech	part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
DFS70 antibody positive control	Trinity Biotech	part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240
Negative control	Trinity Biotech	part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Anti-human IgG FITC conjugate containing Evan's blue counterstain	Trinity Biotech	part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Buffer diluent for serum	Trinity Biotech	part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Phosphate buffered saline (PBS)	Trinity Biotech	part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Mounting medium	Trinity Biotech	part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Coverslips	Trinity Biotech	part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
ImmuGlo ANA HEp-2 Cells 12 well slide sealed individually in pouch	Trinity Biotech	part of kit# 1103, 1103-240
Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials used in the study but not provided by the kits
Diagnostic fluorescent microscope	Nikon Eclipse 50i		Equipped with a spot dignostic camera, model 2.2.1
Incubation chamber	Trinity Biotech		provided for customers (no catalog #)
Coplin jar	n/a		General labware
Paper towels	n/a		General lab supplies
distilled/deionized water	n/a		General lab supplies

References

. Position Statement. Methodology of testing for antinuclear antibodies Available from: https://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/Methodology%20of%20Testing%20Antinuclear%20Antibodies%20Position%20Statement.pdf (2011)
Meroni, P. L., Schur, P. H. ANA screening: an old test with new recommendations. Ann Rheum Dis. 69 (8), 1420-1422 (2010).
Agmon-Levin, N., et al. International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies. Ann Rheum Dis. 73 (1), 17-23 (2014).
Chan, E. K., et al. Report of the First International Consensus on Standardized Nomenclature of Antinuclear Antibody HEp-2 Cell Patterns 2014-2015. Front Immunol. 6, 412 (2015).
Malyavantham, K., Suresh, L. Analysis of DFS70 pattern and impact on ANA screening using a novel HEp-2 ELITE/DFS70 knockout substrate. Auto Immun Highlights. 8 (1), 3 (2017).
Sperotto, F., Seguso, M., Gallo, N., Plebani, M., Zulian, F. Anti-DFS70 antibodies in healthy schoolchildren: A follow-up analysis. Autoimmun Rev. , (2017).
Ayaki, M., et al. Detection of cytotoxic anti-LEDGF autoantibodies in atopic dermatitis. Autoimmunity. 35 (5), 319-327 (2002).
Ochs, R. L., et al. Autoantibodies to DFS 70 kd/transcription coactivator p75 in atopic dermatitis and other conditions. J Allergy Clin Immunol. 105 (6 Pt 1), 1211-1220 (2000).
Watanabe, A., et al. Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers. Arthritis Rheum. 50 (3), 892-900 (2004).
Yamada, K., et al. Humoral immune response directed against LEDGF in patients with VKH. Immunol Lett. 78 (3), 161-168 (2001).
Seelig, C. A., Bauer, O., Seelig, H. P. Autoantibodies Against DFS70/LEDGF Exclusion Markers for Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases (SARD). Clin Lab. 62 (4), 499-517 (2016).
Ochs, R. L., et al. The significance of autoantibodies to DFS70/LEDGFp75 in health and disease: integrating basic science with clinical understanding. Clin Exp Med. 16 (3), 273-293 (2016).
Bizzaro, N., et al. Specific chemoluminescence and immunoasdorption tests for anti-DFS70 antibodies avoid false positive results by indirect immunofluorescence. Clin Chim Acta. 451 (Pt B), 271-277 (2015).
Bizzaro, N., et al. Antibodies to the lens and cornea in anti-DFS70-positive subjects. Ann N Y Acad Sci. 1107, 174-183 (2007).
Daniels, T., et al. Antinuclear autoantibodies in prostate cancer: immunity to LEDGF/p75, a survival protein highly expressed in prostate tumors and cleaved during apoptosis. Prostate. 62 (1), 14-26 (2005).
Dellavance, A., et al. The clinical spectrum of antinuclear antibodies associated with the nuclear dense fine speckled immunofluorescence pattern. J Rheumatol. 32 (11), 2144-2149 (2005).
Gundin, S., et al. Measurement of anti-DFS70 antibodies in patients with ANA-associated autoimmune rheumatic diseases suspicion is cost-effective. Auto Immun Highlights. 7 (1), 10 (2016).
Kang, S. Y., Lee, W. I. Clinical significance of dense fine speckled pattern in anti-nuclear antibody test using indirect immunofluorescence method. Korean J Lab Med. 29 (2), 145-151 (2009).
Lee, H., Kim, Y., Han, K., Oh, E. J. Application of anti-DFS70 antibody and specific autoantibody test algorithms to patients with the dense fine speckled pattern on HEp-2 cells. Scand J Rheumatol. 45 (2), 122-128 (2016).
Mariz, H. A., et al. Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody-positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases. Arthritis Rheum. 63 (1), 191-200 (2011).
Marlet, J., et al. Thrombophilia Associated with Anti-DFS70 Autoantibodies. PLoS One. 10 (9), e0138671 (2015).
Mercado, M. V., et al. Detection of autoantibodies to DSF70/LEDGFp75 in Mexican Hispanics using multiple complementary assay platforms. Auto Immun Highlights. 8 (1), 1 (2017).
Muro, Y., Sugiura, K., Morita, Y., Tomita, Y. High concomitance of disease marker autoantibodies in anti-DFS70/LEDGF autoantibody-positive patients with autoimmune rheumatic disease. Lupus. 17 (3), 171-176 (2008).
Muro, Y., Sugiura, K., Nakashima, R., Mimori, T., Akiyama, M. Low prevalence of anti-DFS70/LEDGF antibodies in patients with dermatomyositis and other systemic autoimmune rheumatic diseases. J Rheumatol. 40 (1), 92-93 (2013).
Mutlu, E., Eyigor, M., Mutlu, D., Gultekin, M. Confirmation of anti-DFS70 antibodies is needed in routine clinical samples with DFS staining pattern. Cent Eur J Immunol. 41 (1), 6-11 (2016).
Okamoto, M., et al. Autoantibodies to DFS70/LEDGF are increased in alopecia areata patients. J Autoimmun. 23 (3), 257-266 (2004).
Pazini, A. M., Fleck, J., dos Santos, R. S., Beck, S. T. Clinical relevance and frequency of cytoplasmic and nuclear dense fine speckled patterns observed in ANA-HEp-2. Rev Bras Reumatol. 50 (6), 655-660 (2010).
Schmeling, H., et al. Autoantibodies to Dense Fine Speckles in Pediatric Diseases and Controls. J Rheumatol. 42 (12), 2419-2426 (2015).
Wiik, A. S., Hoier-Madsen, M., Forslid, J., Charles, P., Meyrowitsch, J. Antinuclear antibodies: a contemporary nomenclature using HEp-2 cells. J Autoimmun. 35 (3), 276-290 (2010).
Mahler, M., Fritzler, M. J. The Clinical Significance of the Dense Fine Speckled Immunofluorescence Pattern on HEp-2 Cells for the Diagnosis of Systemic Autoimmune Diseases. Clin Dev Immunol. 2012, 494356 (2012).
Mahler, M., et al. Anti-DFS70/LEDGF Antibodies Are More Prevalent in Healthy Individuals Compared to Patients with Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases. J Rheumatol. 39 (11), 2104-2110 (2012).
Conrad, K., Rober, N., Andrade, L. E., Mahler, M. The Clinical Relevance of Anti-DFS70 Autoantibodies. Clin Rev Allergy Immunol. , (2016).
Miyara, M., et al. Clinical Phenotypes of Patients with Anti-DFS70/LEDGF Antibodies in a Routine ANA Referral Cohort. Clin Dev Immunol. 2013, 703759 (2013).
Bizzaro, N., Tonutti, E., Villalta, D., et al. Recognizing the dense fine speckled/lens epithelium-derived growth factor/p75 pattern on HEP-2 cells: not an easy task! Comment on the article by Mariz et al. Arthritis Rheum. 63 (12), 4036-4037 (2011).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Malyavantham, K. S., Suresh, L. Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate. J. Vis. Exp. (131), e56722, doi:10.3791/56722 (2018).

Automatically Generated

ההבחנה סימולטני של Monospecific ודפוסי DFS70 מעורב במהלך ההקרנה אנה עם מצע נוקאאוט הרומן של עלית/DFS70 דלקת-2

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Tags

Play Video

Cite This Article

View Video

Automatically Generated

ההבחנה סימולטני של Monospecific ודפוסי DFS70 מעורב במהלך ההקרנה אנה עם מצע נוקאאוט הרומן של עלית/DFS70 דלקת-2

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Tags

Play Video

Cite This Article

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below