JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Gelijktijdige onderscheid van monospecifieke en gemengde DFS70 patronen tijdens ANA Screening met een roman HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout substraat

Published: January 17, 2018
doi:
10.3791/56722
,
1Research & Development, Immco Diagnostics,A Trinity Biotech Company

Summary

DFS70 autoantilichamen nabootsen gemeenschappelijk ziekte-geassocieerde antinuclear antilichaam patronen maken nauwkeurige interpretatie uitdaging bij het gebruik van conventionele HEp-2 substraten. Het protocol beschrijft de voordelen van roman gemanipuleerde HEp-2 substraat ten opzichte van conventionele HEp-2 in ANA screening en het registratienummer van de DFS70 patronen met hoge vertrouwen in zowel monospecifieke als gemengde ANA positieve gevallen.

Abstract

Systemische auto-immuunziekten bindweefsel aandoeningen worden gekenmerkt door het circuleren van antinuclear antilichamen (ANA). Hoewel er verschillende technologieën beschikbaar voor ANA screening zijn, blijft indirecte immunofluorescentietest (IIF) met behulp van menselijke epitheliale cellen-2 (HEp-2) ondergrond de primaire en aanbevolen methode vanwege de superieure gevoeligheid. HEp-2 substraten kunnen detecteren een veelheid van patronen die voortvloeien uit autoantibody bindend aan verschillende proteïnen en nucleic zuur autoantigens verspreid over de celkern en het cytoplasma van de cellen. De grote diversiteit van monospecifieke en gemengde patronen als gevolg van positieve reacties op HEp-2 substraat ook compliceren de interpretatie en de nauwkeurigheid van de rapportage. Een concreet voorbeeld waaraan de grootst mogelijke aandacht onlangs is het dichte fijne gespikkelde 70 (DFS70) patroon als gevolg van autoantilichamen dat specifiek aan een eiwit genaamd lens afgeleid epitheel groeifactor (LEDGF bindt). Gebrek aan duidelijke associatie met een specifieke systemische auto-immune ziekten en de hoge prevalentie in gezonde populaties hebben nauwkeurige interpretatie van DFS70 patroon Belangrijk gemaakt. Nauwkeurig onderscheid van DFS70 patroon van de ziekte-geassocieerde patronen met behulp van conventionele HEp-2 substraat is uitdagend. Bovendien frequent co vóórkomen van DFS70 patroon samen met ziekte-geassocieerde patronen zoals homogene, gespikkelde en gemengde patronen met homogene-speckled compliceren de IIF-interpretatie. Het doel van deze paper is om aan te tonen dat het nut van een roman ontworpen HEp-2 IIF substraat dat alle voordelen van conventionele HEp-2 substraat behoudt terwijl gelijktijdig het vermogen om te onderscheiden DFS70 patroon met hoge vertrouwen in beide monospecifieke en gemengde ANA positieve voorbeelden. Het nieuwe substraat kan verder ziekte-geassocieerde ANA patronen eerder verborgen en vervangen door DFS70-patroon te ontmaskeren.

Introduction

ANAs zijn een kenmerk van auto-immuun gemedieerde systemische bindweefsel ziekten1. Verschillende methoden zijn gebruikt voor screening en bevestiging van ANAs. IIF techniek met behulp van de HEp-2 substraat blijft de meest gebruikte en vaak aanbevolen methode voor het screenen van ANAs1,2. Ondanks de vooruitgang in de vaste fase diagnostische test methodologieën zoals enzym gekoppelde immunosorbent analyse (ELISA), enzyme-immunoassay (EIA), chemiluminescentie-immunoassay (CLIA) en multiplex assays kraal gebaseerde is IIF door HEp-2 de meest voorkomende screening methode vanwege de diagnostische nut en kosten effectiviteit1,2,3. De technologieën van bovengenoemde bepaling is afhankelijk van een beperkte set van gezuiverde native of recombinant autoantigens terwijl de HEp-2 cel enkelgelaagde voorbereidingen op glas dia wells een uitgebreid scala aan autoantigens in hun natuurlijke vorm presenteren, verdeeld over de celkern en het cytoplasma, die reageren met de autoantilichamen van patiënt sera of positieve controles, wat resulteert in een veelheid van patronen die gekoppeld aan diverse auto-immune aandoeningen zijn. Deze patronen worden ingedeeld in nucleaire cytoplasmatische en mitotische patronen op basis van de locatie van het antigeen in de cellen. Elk patroon en de bijbehorende antigeen/antigenen en ziekte staten zijn goed gekarakteriseerd4. In de IIF-methode, worden patiënt en controle sera geïncubeerd op glas dia putten die een enkelgelaagde cultuur van HEp-2 cellen voldoende bevestigd presenteren aan een veelheid van autoantigens in hun natuurlijke configuratie behouden. De autoantilichamen in de patiënt sera of positieve controles zijn toegestaan om te binden aan de autoantigens HEp-2 cellen op het substraat (glasplaatje goed) heeft voorgelegd tijdens de incubatie. Na incubatie, niet-afhankelijke antistoffen zijn afgewassen en gebonden antilichamen van de IgG-klasse worden gedetecteerd met fluoresceïne/fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) geconjugeerd anti-mens IgG reagens. Niet-afhankelijke gemeld-conjugate is weggespoeld en het glas coverslips worden gemonteerd op de top van de dia’s met behulp van een montage-medium waarmee de reacties wordt behouden en observatie onder een fluorescente microscoop vergemakkelijkt. Reacties worden waargenomen onder een fluorescentie Microscoop uitgerust met passende excitatie-emissie filtercombinatie die is geconfigureerd volgens de verslaggever gebruikt (voor de FITC-verslaggever, een diagnostische Microscoop meestal maakt gebruik van filters met excitatie bereik van 467 -498 nm en een bereik van de emissie van 513-556 nm). De aanwezigheid van ANA wordt aangetoond door een helder groene fluorescentie van specifieke structuren in de cellen. In tegenstelling tot geautomatiseerde assay platforms steunt IIF methodologie op het moeizame proces van seriële verdunning van de sera en de visuele positieve bepaling van de kleuring patronen waarvoor noemenswaardig deskundigheid5,6. Ondanks deze beperkingen, IIF door HEp-2 blijft de meest gebruikte en aanbevolen methode voor het screenen van ANAs als gevolg van de normalisatie-inspanningen voor patroon interpretatie en nomenclatuur door de internationale consensus over ANA patronen (ICAP) Comité, toegenomen beschikbaarheid van automatiseringsoplossingen voor de IIF dia verwerking en resultaat interpretatie3.

Onder de vele patronen ontdekt door de HEp-2 IIF-methode en autoantilichamen gericht op het psip1 gen product (ook LEDGF/p75/DFS70 genoemd), hebben opgedaan significant belang in de afgelopen jaren voor verschillende redenen4,5 ,6,7,8,9,10. DFS70 autoantilichamen aanwezig zijn in hoge titers in gezonde controles en onderzoeken tot nu toe niet is gelukt om aan te tonen van een verschillende klinische vereniging voor de aanwezigheid van DFS70 autoantilichamen7,8,9 ,10,11,12,13. De tarieven van gerapporteerde positieve resultaten voor DFS70 autoantilichamen in verschillende staten van de ziekte en gezonde cohorten sterk uiteen tussen studies6,8,9,10,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Het monospecifieke DFS70-patroon is goed onderscheiden van een homogene of gespikkeld patroon maar interpretatie van gemengde homogene-speckled patronen en anti-DFS70 antilichamen samen voorkomen met andere ANAs is uitdagend zelfs voor deskundige lezers. De huidige generatie van IIF screening methoden en DFS70 specifieke vaste fase vitrotests zijn niet geschikt voor differentiatie van een monospecifieke DFS70 reactie van gemengde patronen (figuur 1A, geel gearceerde gebied van het algoritme). Verkeerde interpretatie van DFS70 patroon als homogene, gespikkelde, of gemengd patroon, of vice versa, kan ernstige gevolgen hebben voor patiëntenzorg. De huidige gebruikte protocol is als volgt: de klinische labs dienst een aantal vaste fase bevestigingstests voor ziekte-geassocieerde ANAs en/of een immunoadsorption methode voor DFS70/LEDGF als dichte boete (AC-2) patroon gespikkelde wordt vermoed (figuur 1a)4,5.

Het doel van dit protocol is om aan te tonen het nut van een roman ontworpen HEp-2 IIF substraat (HEp-2 ELITE/DFS70 knock-out (KO), zal worden verwezen als HEp-2 ELITE) die behoudt alle voordelen van conventionele HEp-2 voor het screenen van ANAs terwijl tegelijkertijd DFS70 patroon onderscheid te maken met het hoge vertrouwen in zowel monospecifieke als gemengde ANA positieve gevallen (figuur 1B, geel gearceerde gebied van het algoritme)5. HEp-2 ELITE substraat bestaat uit een geschatte mengsel van ongewijzigde conventionele HEp-2 cellen en gemanipuleerde cellen verstoken van LEDGF/p75/DFS70 antigeen in 1:9 verhouding5. De IIF-procedure voor HEp-2 ELITE is identiek aan de conventionele methode van de HEp-2. De unieke configuratie van HEp-2 ELITE substraat behoudt alle voordelen van conventionele HEp2 maar homogene, gespikkelde en gemengde reactie patronen kunt onderscheiden van DFS70 patroon op de eerste screening of het testen van een monster (figuur 1B )5. Patiënt sera te worden gereageerd op dia’s met HEp-2 IIF substraat moet verdund 1:40 met screening verdunning of volgens het criterium van de individuele laboratorium. Een specifieke reactie op 1:40 of hogere titer wordt als positief beschouwd.

In deze studie, positieve sera voor homogene, gespikkelde, centromeer, nucleolar, cytoplasmatische reticulaire/AMA en DFS70 patronen die geproduceerd een middellange positief signaal (ten opzichte van de negatieve controle en positieve ANA controle geboden door de kit) bij screening verdunning van 1:40 werden geselecteerd voor het simuleren van de mono-specifieke en gemengde patronen op HEp-2 substraten (conventionele en HEp-2 ELITE). De 1:40: verdunde DFS70 positieve sera waren gemengd met 1:40 verdunningen van afzonderlijke ziekte-geassocieerde ANA patroon besturingselementen (homogene, gespikkelde, centromeer, nucleolar, of cytoplasmatische reticulaire-AMA) in verschillende verhoudingen (controle: DFS70 in 100:0, 80:20, 50:50, 20:80 en 0:100) en niet op conventionele geëvalueerd en HEp-2 ELITE substraten na IIF standaardprocedure zoals hieronder beschreven.

Protocol

Het protocol volgt de richtsnoeren van Trinity Biotech institutioneel menselijke onderzoek ethisch comité. 1. steekproef en substraat voorbereiding Zakjes met substraat dia’s toestaan (glas van dia’s met 12 putjes op elke dia met HEp2 of HEp-2 + HEp2 KO cel mengsel) ter equilibreer tot kamertemperatuur voor optimale prestaties en voorkoming van condensatie van vocht op dia oppervlak voorafgaand aan de toevoeging van monster. Dit moet duren ongeveer 10-15 min. Zodra geëquilibreerd tot kamertemperatuur, verwijder voorzichtig de substraat dia’s met behulp van de vingers zonder ze aan te raken de zijkanten van het zakje. Label van dia’s en plaats ze in een zaal van de incubatie (op kamertemperatuur) bekleed met keukenpapier vochtig met water om te voorkomen dat het drogen van dia’s tijdens monster en geconjugeerde incubatie.Opmerking: Niet-specifieke kleuring kan voortvloeien uit de droge putten; een natte papieren handdoek binnen de incubatie kamer biedt vochtigheid en voorkomt dat goed droogte. 2. toevoeging van besturingselementen en monsters Afzien ongeveer 50 µL van de negatieve/positieve controles, combinaties van DFS70-ANA positieve sera zoals beschreven in deze studie, of de patiënt serummonsters op afzonderlijke dia wells. Afzien controlegroep(en) en monsters in elk putje op de dia. Om te voorkomen dat goed kruisbesmetting, Vermijd de putten. Terwijl geen overvulling wells, zorgen voor volledige dekking van goed oppervlak en luchtbellen voorkomen.Opmerking: De aanbevolen volumewaarde bedraagt 50 µL per stap 2.1. Plaats het deksel op de incubatie-zaal en dia’s gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Als er ANA in het serum van de patiënt aanwezig is, wordt het gebonden aan de cellen in elk putje in deze incubatieperiode aanwezig. Zodra de incubatieperiode voorbij is, verwijdert u de dia uit de incubatie-zaal. Houd de dia tabblad eind en spoel zachtjes met ongeveer 10 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) was buffer geleverd in de kit, met behulp van een precisiepipet of in een bekerglas gevuld met PBS voor 10-15-s. overdragen van de dia onmiddellijk in een Coplin pot met PBS was buffer en wassen ( Geniet) voor 10 min. Herhaal het proces met alle resterende glijbanen.Opmerking: Bij het plaatsen van meerdere dia’s in een Coplin pot, zorgen dat de kant van de cel van de dia geen contact op met een andere dia, aangezien dit zal resulteren in beschadiging van de cellen vastgehouden op het glasplaatje. 3. de toevoeging van fluorescerende Conjugate Slechts één dia tegelijk verwijderen uit de pot van de Coplin. Om te verwijderen het overtollige PBS was buffer van de dia, zachtjes tik of blot het schuifje op de papieren handdoek. Elke kit wordt geleverd met FITC label anti-menselijke IgG fluorescerende geconjugeerde. Aan elk putje, voorzichtig toepassing 1 druppel (ongeveer 50 µL) van de verstrekte geconjugeerde. Laat de dia’s in de gesloten kleuring kamer van de incubatie gedurende 30 minuten inwerken.Opmerking: Het gebruik van Fc specifieke IgG conjugaat wordt aanbevolen. Als er ANA aanwezig in het serum van de patiënt, wordt de geconjugeerde gebonden aan de cellen in elk putje aanwezig tijdens deze incubatieperiode, wat in de specifieke fluorescentie van de cellen aanwezig in de putjes resulteert. De geconjugeerde is gevoelig voor licht. De kamer gesloten incubatie zal bijdragen tot een lichte verstoring van de geconjugeerde reactie van de cellen aanwezig in elk putje wordt voorkomen. Zodra de incubatieperiode voorbij is, verwijdert u de dia uit de incubatie-zaal. Houd de dia aan het einde van tab en spoel zachtjes met ongeveer 10 mL PBS was buffer in de kit, met behulp van een precisiepipet of in een bekerglas gevuld met PBS. Breng de dia onmiddellijk in een Coplin pot met PBS was buffer en wassen (weken) voor 10 min. Herhaal het proces met alle resterende dia’s.Opmerking: Bij het plaatsen van meerdere dia’s in een Coplin pot, zorgen dat de kant van de cel van de dia geen contact op met een andere dia, aangezien dit zal resulteren in beschadiging van de cellen vastgehouden op het glasplaatje. Plaats de coverslips die worden geleverd in de kit op een droog papieren handdoek. De montage media is voorzien van de kit. De onderste rand van het dekglaasje aan, van toepassing zijn tussen 3-4 druppels van de media van de montage in een lijn. Neem één dia tegelijk uit de pot van de Coplin met de buffer wassen. Als u wilt verwijderen van de overtollige was buffer, zachtjes tik of blot het schuifje op de papieren handdoek. Verlaag de dia zachtjes op het dekglaasje aan door het plaatsen van de onderste rand van de dia aan de rand van het dekglaasje aan. Dit maakt de montage media aanwezig op de onderste rand dekglaasje aan stroom naar de bovenrand van de dia, en minimaliseert de vorming van luchtbellen, die met de lezing van de elk putje van een dia interfereren kunnen.Opmerking: Minimale druk moet worden gebruikt voor het monteren van de cover dia op de dia. Overdruk kan zijdelingse beweging van de cover glijdt. Dit kan leiden tot schade aan de enkelgelaagde voorbereiding van de cellen en het resultaat in vervorming. De dia’s opslaan in het donker bij 2-8 ° C. De dia’s onderzoeken zodra ze zijn gemonteerd of binnen 48 uur.Opmerking: Langere opslag kan leiden tot verslechtering van de patroon en fluorescent signaal. 4. identificatie van positieve en negatieve resultaten De dia’s weergeven met een fluorescente microscoop met behulp van een FITC filter set, gelegen in een donkere kamer. Onderzoeken voor specifieke helder groene fluorescentie onder een fluorescentie Microscoop bij een vergroting van 200 X of groter te maken van de definitieve interpretatie met betrekking tot positiviteit en patroon. Let op de positieve en negatieve controles.Opmerking: De positieve controle verschijnt helder groene fluorescentie in de kern (figuur 2A, homogene). De negatieve controle verschijnt geen specifieke groene fluorescentie onder een fluorescentie Microscoop. Opnemen van de positieve/negatieve resultaat voor elk putje en omvatten het ANA patroon voor positieve gevallen.

Representative Results

HEp-2 ELITE/DFS70 KO substraat behoudt van klassieke ANA patronen en vergemakkelijkt duidelijk onderscheid van DFS70 patroon: Conventionele en gemodificeerde cellen op HEp-2 ELITE/DFS70 KO substraat zijn identiek, behoud van alle autoantigens met uitzondering van de LEDGF/p75. De negatieve controle geboden door de kit stelt de basislijn fluorescent signaal. Positieve controles voor homogene, gespikkelde, centromeer, nucleolar en mitochondriale patronen op HEp-2 ELITE produceren een patroon identiek aan verwachte patronen op conventionele HEp-2 IIF substraat (figuur 2A). Deze referentie-patronen zijn beschreven in detail samen met elk patroon van antigeen en ziekte vereniging eerder4,29. Een korte beschrijving van patronen waargenomen in figuur 2A zijn gegeven in tabel 1. DFS70 patroon op HEp-2 ELITE: Ongeveer 10% van de cellen in elk goed Toon een dichte fijn gespikkeld patroon (ICAP toegewezen nomenclatuur: AC-2) die kunnen worden waargenomen op de interfase kern en chromatine verbonden kleuring wordt gezien op de mitotische kernen (figuur 2B). Op een conventionele HEp-2 substraat, zullen alle cellen hebben dit patroon wanneer reageerde met een DFS70 positief monster. De resterende ~ 90% van de HEp-2 cellen hebben het psip1 gen codering van het LEDGF antigeen gevloerd en daarom niet zal produceren een signaal of patroon wanneer reageerde met een monospecifieke DFS70 positief serum (figuur 2B). 10% van de HEp-2 cellen hebt helderder fluorescentie overeenkomt met het patroon van de DFS70 en de rest van de cellen aanwezig extra patronen (bijvoorbeeld prima gespikkelde of nucleolar), geeft dit de aanwezigheid van gemengde patronen. Nader onderzoek van deze patronen is essentieel voor het bevestigen van alle kenmerken van de autoantibody die naast het DFS70 patroon aanwezig zijn. Om aan te tonen van het vermogen van de HEp-2 ELITE substraat, een panel van sera monsters is gemaakt met verschillende concentraties van DFS70 en ANA positieve controle van sera en getest op zowel conventionele en HEp-2 ELITE substraten met behulp van een standaard IIF protocol (Figuur 3 , Figuur 4 Figuur 5, Figuur 6, Figuur 7). Interpretatie van DFS70 monospecifieke en gemengde reacties op conventionele en HEp-2 ELITE ondergronden: Voor elke specifieke ziekte-geassocieerde ANA patroon (Figuur 3, Figuur 4 Figuur 5, Figuur 6, Figuur 7), een monospecifieke ANA patroon aan linkerkant meeste kolom en een monospecifieke DFS70 patroon aan rechterkant meeste kolom kunnen worden waargenomen. De drie kolommen in het midden vertegenwoordigen verschillende verhoudingen van ziekte-geassocieerde en positieve controles van het patroon van DFS70. De resulterende gemengde patronen zijn uitdagend te onderscheiden op conventionele HEp-2 substraat (Figuur 3, Figuur 4, Figuur 5, Figuur 6, Figuur 7, bovenste rij). Echter met de roman Hep-2 ELITE substraat, in de meeste van de monsters, verschilt het verschil in intensiteit tussen de ongewijzigde en gemanipuleerde cellen die bevestigt niet alleen de aanwezigheid van DFS70 autoantilichamen (wanneer de verhouding helderder naar minder helder cellen tussen 1:9), maar blijkt ook een secundaire ANA-patroon. In het geval van homogene-DFS70 of gespikkelde-DFS70 tekenen van onrust, is het onmogelijk te voorspellen met vertrouwen de juiste patroon dat tot de labs kiezen leidt voor het uitvoeren van een aantal aanvullende tests (figuur 1A). In het geval van centromeer-DFS70 en nucleolar-DFS70 tekenen van onrust, vermoeden DFS70 positiviteit is zeer uitdagend (Figuur 5, Figuur 6). Met nucleolar en cytoplasmatische reticulaire/AMA reacties is het DFS70 patroon niet dominant, totdat de sera verhouding 50% bereikt. In alle voorbeelden, de HEp-2 ELITE substraat kan presenteren het patroon van de DFS70 en de onderliggende secundaire patroon over een breder scala van intensiteit niveaus en dus een nauwkeuriger ANA interpretatie vergemakkelijkt. Nauw observeren de gemengde patronen, resultaten voor verschillende combinaties van de 50:50 van ANA en DFS70 positieve controles werden uitgebreide (Figuur 8) voor zowel conventionele en HEp-2 ELITE substraten. Het wordt aangemoedigd om het observeren van de interfase zowel mitotische kleuring voor alle ANA patronen met inbegrip van de DFS70 op HEp-2 substraten ter verbetering van de interpretatie en de nauwkeurigheid van de gerapporteerde patroon. Echter voor gemengde patronen volstaan de differentiële patroon gepresenteerd door het verdelen van de celkernen niet om nauwkeurige interpretatie. Rode pijlen (Figuur 8) geven de mitotische kernen in zowel conventionele en gemodificeerde cel. Het kan worden waargenomen dat gemengd van DFS70 reacties op cellen verdelen niet in overeenstemming met de vastgestelde reeks regels voor interpretatie van het ziekte-geassocieerde ANA patronen. Gele en blauwe pijlen geven de ongewijzigde en gemanipuleerde (DFS70 KO) HEp-2 celkernen, respectievelijk. In alle combinaties (Figuur 8), een duidelijke intensiteit verschil tussen de ongewijzigde cel nucleaire kleuring (~ 10%) en de gemodificeerde cel nucleaire (~ 90%) patroon in de dezelfde microscopische gezichtsveld wordt waargenomen, waardoor gelijktijdige screening en bevestiging van het DFS70 patroon. Figuur 1: ANA screening algoritmen met conventionele methoden van de HEp-2 en HEp-2 ELITE/DFS70 KO IIF. (A) schema ontrafelt het tekort aan conventionele HEp-2 IIF in het identificeren van monospecifieke en gemengde DFS70 positieve patronen in het stadium van de screening (geel gearceerde gebied) en haar onvermogen om uit te sluiten een secundaire ziekte-geassocieerde ANA patroon dat kan worden verborgen en vervangen door DFS70 patroon. Verder, de huidige generatie van DFS70 specifieke vaste fase bevestigende tests zijn niet in staat om te bevestigen monospecifieke DFS70 positiviteit die leidt tot extra bevestigende tests voor ANAs. (B) Schematische onthult de mogelijkheden van de HEp-2 ELITE voor screening van ANAs, gelijktijdige onderscheid van monospecifieke en gemengde DFS70 bijwerkingen, en elimineren de noodzaak voor vaste fase DFS70 bevestiging testen. Algoritme HEp-2 ELITE aanzienlijk vereenvoudigt het ANA screening en vermindert het vereiste aantal bevestiging testen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2: Classic ANA en DFS70 patroon op HEp-2 ELITE/DFS70 KO substraat. (A) HEp-2 ELITE/DFS70 KO substraat behoudt klassieke ANA patronen. Klassieke homogene reactie en DFS70 positieve reacties waren geproduceerd met behulp van de positieve controle geboden door de kit. Andere reacties werden geproduceerd met behulp van tevoren vastgelegde positieve controlesera voor gespikkelde, centromeer, nucleolar en cytoplasmatische reticulaire/AMA reacties5. (B) HEp-2 ELITE/DFS70 KO substraat biedt zowel conventionele en gemodificeerde cellen, die gemakkelijk onderscheid van DFS70 patroon vergemakkelijkt. Schema toont de resulterende DFS70 monospecifieke reactie en het patroon op de interfase kleuring en celkernen voor zowel conventionele en gemodificeerde (DFS70-KO) cellen verdelen. Gemanipuleerde HEp-2 cellen zijn verstoken van LEDGF/p75/DFS70 antigeen waarmee de simultane detectie van secundaire patronen die gewoonlijk verborgen en door DFS70 autoantibody reactie op conventionele HEp-2 substraten vervangen worden. Voorbeelden van mitotische celkernen geven pijlen (geel). Schaal staven 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3: DFS70 en homogene sera in combinatie. DFS70 monospecifieke sera werden gecombineerd met een positieve homogene patroon controle in verschillende verhoudingen (100:0, 80:20, 50:50, 20:80 en 0:100) en getest op conventionele en gemodificeerde (DFS70-KO) HEp-2 substraten. Schaal staven 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4: DFS70 en sera in combinatie gespikkelde. DFS70 monospecifieke sera werden gecombineerd met een positieve gespikkelde patroon controle in verschillende verhoudingen (100:0, 80:20, 50:50, 20:80 en 0:100) en getest op conventionele en gemodificeerde (DFS70-KO) HEp-2 substraten. Schaal staven 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 5: DFS70 en centromeer sera in combinatie. DFS-70 monospecifieke sera werden gecombineerd met een positieve centromeer patroon controle in verschillende verhoudingen (100:0, 80:20, 50:50, 20:80 en 0:100) en getest op conventionele en gemodificeerde (DFS70-KO) HEp-2 substraten. Schaal staven 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 6: DFS70 en nucleolar sera in combinatie. DFS-70 monospecifieke sera werden gecombineerd met een positieve nucleolar patroon controle in verschillende verhoudingen (100:0, 80:20, 50:50, 20:80 en 0:100) en getest op conventionele en gemodificeerde (DFS70-KO) HEp-2 substraten. Schaal staven 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 7: DFS70 en cytoplasmatische reticulaire/AMA sera in combinatie. DFS70 monospecifieke sera werden gecombineerd met een positieve mitochondriale patroon controle in verschillende verhoudingen (100:0, 80:20, 50:50, 20:80 en 0:100) en getest op conventionele en gemodificeerde (DFS70-KO) HEp-2 substraten. Schaal staven 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 8: Gemengde patronen (50:50 ratio) geproduceerd op conventionele en HEp-2 ELITE substraten. Verschillen tussen de twee substraten worden onthuld. Rode pijlen geven de mitotische kernen in zowel conventionele en gemodificeerde cellen op beide ondergronden. Voor deze combinaties is de differentiële patroon gepresenteerd door celkernen op conventionele HEp-2 substraat te verdelen niet voldoende voor nauwkeurige interpretatie van gemengde patronen. Worden kan geconstateerd dat gemengde DFS70 reacties op het verdelen van de cellen kunnen erover de vastgestelde reeks regels voor interpretatie van het ziekte-geassocieerde ANA patronen. Gele en blauwe pijlen geven de ongewijzigde en gemanipuleerde (DFS70 KO) HEp-2 celkernen, respectievelijk. Resultaten voor alle combinaties getest op de gemanipuleerde substraat: een duidelijke intensiteit verschil tussen de interfase nucleaire patroon behorend tot ongewijzigde cellen (~ 10%) en gemanipuleerde cellen (~ 90%) werd waargenomen, waardoor gelijktijdige opsporing en bevestiging van DFS70 patroon. Schaal staven 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. ANA patroon Beschrijving Homogene De gehele kern fluoresceert gelijkmatig met een diffuse kleuring patroon. Gespikkelde Discrete, grof aan fijne spikkels van lichten in de kern.  Fijn gespikkeld en grof gezaagde patronen zijn beschreven. Nucleolar De nucleoli vlek als meerdere vaste of gespikkelde organen in de kern. Subtypen zijn eerder beschreven. Centromeer Grote spikkels van eindig aantal. Reactieve antigeen beveiligingsmethode met verkorte chromosomen in de cellen mitose ondergaan. Cytoplasmatische reticulaire/AMA Het cytoplasma verschijnt granulaire met positieve kleuring van het mitochondrium. DFS70 •Conventional HEp-2 cellen: een dichte fijn gespikkeld patroon is waargenomen op de interfase nucleus en chromatine verbonden kleuring wordt gezien op de mitotische kernen. •Engineered DFS70 KO cellen: Anti-DFS70 antilichamen produceren negatieve kleuring HEp-2 Elite / DFS70 KO conventionele en gemodificeerde (DFS70 KO) cellen in ongeveer 1:9-verhouding heeft. Conventionele cellen produceren typische DFS70 patroon en gemanipuleerde cellen produceren een negatieve patroon wanneer reageerde met een DFS70 monospecifieke/geïsoleerd positieve reacties. Tabel 1: beschrijving van ANA patronen.

Discussion

Autoantilichamen aan nucleaire en cytoplasmatische antigenen zijn zeer wijd verspreid is in systemische auto-immuunziekten. Hoewel geen enkele test de best mogelijke gevoeligheid en specificiteit biedt, wordt IIF door HEp-2 beschouwd als een zeer gevoelige en kosteneffectieve screeningsmethode voor systemische auto-immuunziekten2,3,4 . Ondanks de prevalentie van IIF protocol voor meer dan 50 jaar is nauwkeurigheid van IIF-test sterk afhankelijk van de vaardigheid van de technicus, zorgvuldige uitvoering van de afzonderlijke stappen van het protocol, en nauwkeurige interpretatie van de resultaten met behulp van een goed onderhouden fluorescentie Microscoop. Diagnose van systemische auto-immune ziekte moet niet worden gebaseerd op de resultaten van een enkele serologische test zoals IIF door HEp-2.

Reconstructie van reagentia met behulp van hoge kwaliteit water (gedestilleerd/gedeïoniseerd), gebruik van gestandaardiseerde kit onderdelen (dia’s met HEp-2 cel monolayers, monster verdunningsmiddel, positieve en negatieve controles, vooraf verdunde geoptimaliseerde FITC-conjugaat en montage medium) een positief effect hebben op de resultaten. Overslaan van de toevoeging van besturingselementen of monsters op putten kan aanmoedigen vals negatieve interpretaties. Drogen van dia’s op elk gewenst moment na de toevoeging van monster of besturingselement in artefactuele valse positieve reacties en/of onjuiste patronen resulteren kan. Teveel was buffer liet op dia of drogen van dia wells vóór dispensatie van montage medium kan leiden tot artefacten. Onvoldoende hoeveelheid montage medium of het genereren van bubbels op het oppervlak van de dia vóór het plaatsen van een dekglaasje aan toe te voegen kan leiden tot reacties die kijken wazig of onscherp wanneer onder de Microscoop waargenomen. Gekoppelde dia’s moeten worden opgeslagen bij 2-8 ° C en binnen de aanbevolen venster van tijd tot een minimum beperken van vals negatieve of artefactuele resultaten geanalyseerd.

Met behulp van een goed onderhouden epi-belichting fluorescerende Microscoop die beschikt over een geschikte lichtbron LED/Hg/Xenon en schoon optische componenten, met inbegrip van filters voor excitatie en emissie die niet beschadigd zijn is cruciaal voor het verkrijgen van nauwkeurige IIF resultaten. Eindgebruiker opleiding voor discriminerende positieve/negatieve reactie intensiteiten en interpretatie van de patronen is van cruciaal belang. HEp-2 IIF testen zijn kwetsbaar voor gebrek aan standaardisatie in procedures, Microscoop configuratie, en training voor eindgebruikers of vaardigheid. De consensus nomenclatuur en vertegenwoordiger patronen en voorbeelden van afbeeldingen die zijn verworven met behulp van verschillende fabrikanten zijn ter beschikking gesteld door ICAP () voor onderwijsdoeleinden4. Een HEp-2 cel patroon classificatie boom geboden door ICAP voor verschillende nucleaire cytoplasmatische en mitotische patronen is een waardevolle bron om te leren van de subtiele verschillen tussen verschillende patronen die op de ongetrainde ogen4 lijken kunnen. Een van de eerste voorbeelden van een uitdagende patroon is de DFS70 die ook een duidelijke associatie met een auto-immune aandoening ontbreekt, en zoals besproken in vorige secties dit patroon is zeer wijd verspreid is in gezonde populaties5.

Afhankelijk van de studie, de prevalentie van anti-DFS70 autoantilichamen variëren tussen gezonde cohorten, ANA screening populaties, en ANA positieve individuen met geen bewijs van systemische auto-immuunziekte9,16,20 ,30,31. DFS70 autoantilichamen zijn bij optreden in isolatie, alsook met andere ziekte-geassocieerde ANA patronen gemeld. Dat werd geïsoleerd of monospecifieke DFS70 patroon wordt gemeld in 2-22% van de gezonde controles maar in minder dan 1% van de gevallen met auto-immune reumatische ziekte32. Op basis van deze trends, werd DFS70 mono-positieve patroon voorgesteld als een criterium om uit te sluiten in auto-immune reumatische ziekten door ICAP Comité3,31,32. Het ICAP-Comité, opgericht ter bevordering van de harmonisatie van de autoantibody test nomenclatuur en interpretatie van de resultaten van de HEp-2 IIF, raadt rapportage DFS70 positiviteit terwijl rapportage ANA screening resultaten4.

Voorafgaand aan dat een systemische auto-immune ziekte op basis van de DFS70 mono-positiviteit wordt uitgesloten, is het essentieel om te controleren van de status van de huidige methoden voor screening en bevestiging (met name die specifiek voor DFS70). Overeenkomst tussen DFS70 positiviteit door HEp-2 IIF en vaste fase confirmatieve vitrotests namelijk ELISA, CLIA en lijn immunoassay/dot vlek methoden) sterk uiteen tussen de verschillende studies13,22,25,33 . IIF interpretatie en bevestigende kwantitatieve analyse parameters die aan deze onenigheid bijdragen geweest besproken eerder5,13,34. Een benadering van de onlangs voorgestelde immunoadsorption voor anti-DFS70 antistof bevestiging heeft betrekking op enkele van de tekortkomingen van de huidige vaste fase testen (voor DFS70) maar vereist de labs een extra stap uitvoeren in IIF procedure op verdachte monsters, die verhoogt de kosten en doorlooptijd tijd voor het rapporteren van resultaten13. Deze extra stap is niet vereist wanneer HEp-2 ELITE/DFS70 KO cellen worden gebruikt voor routine ANA screening. Dit vermindert de totale kosten en bovendien is er geen invloed op de doorlooptijd als DFS70 patroon is onderscheidde in de eerste screening stap27. Een extra nadeel van het gebruik van conventionele HEp-2 IIF-methode is dat het niet in staat om te onderscheiden DFS70 patroon samen voorkomen met andere ANA patronen in het stadium van de screening. Echter, dit nadeel wordt overwonnen door het gebruik van de HEp-2 ELITE/DFS70 KO cellen27.

Vergelijkende evaluatie van conventionele HEp-2 en de nieuwe gemanipuleerde HEp-2 (HEp-2 ELITE/DFS70 KO) met behulp van ANA positieve controles en combinaties daarvan met een mono-positieve DFS70 control, tonen het nut van de nieuwe substraat kunnen gelijktijdig scherm voor ANAs en bevestig DFS70 patroon (Figuur 1). De IIF-protocol voor het nieuwe substraat is identiek aan de conventionele methode van de HEp-2 IIF. Interpretatie regeling voor alle ziekte-geassocieerde ANA patronen is identiek met uitzondering van de patroon van de DFS70 (tabel 1). Interpretatie van zowel mono-positieve als gemengde DFS70 patronen was relatief gemakkelijker met de nieuwe methode, en het garandeert niet meer testen (figuur 1B). Implementatie van deze nieuwe methode in de klinische lab vereenvoudigt de uitdaging die zijn gekoppeld aan de interpretatie van DFS70 patroon en verbetert de algehele nauwkeurigheid van de toetsing door de verdere onthulling ziekte-geassocieerde ANA patronen eerder verborgen en vervangen door ANA DFS70 (gemengd patronen).

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Andrew Zenger voor het uitvoeren van de IIF-experimenten en het verzamelen van beelden.

Materials

HEp-2 ELITE / DFS70-KO 12 Well Slide sealed individually in pouch Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240
ANA positive control Trinity Biotech  part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
DFS70 antibody positive control Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240
Negative control Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Anti-human IgG FITC conjugate containing Evan's blue counterstain Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Buffer diluent for serum Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Phosphate buffered saline (PBS) Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Mounting medium Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Coverslips  Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
ImmuGlo ANA HEp-2 Cells 12 well slide sealed individually in pouch Trinity Biotech part of kit# 1103, 1103-240
Name Company Catalog Number Comments
Materials used in the study but not provided by the kits
Diagnostic fluorescent microscope Nikon Eclipse 50i Equipped with a spot dignostic camera, model 2.2.1
Incubation chamber Trinity Biotech provided for customers (no catalog #)
Coplin jar n/a General labware
Paper towels n/a General lab supplies
distilled/deionized water n/a General lab supplies
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. . Position Statement. Methodology of testing for antinuclear antibodies Available from: https://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/Methodology%20of%20Testing%20Antinuclear%20Antibodies%20Position%20Statement.pdf (2011)
  2. Meroni, P. L., Schur, P. H. ANA screening: an old test with new recommendations. Ann Rheum Dis. 69 (8), 1420-1422 (2010).
  3. Agmon-Levin, N., et al. International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies. Ann Rheum Dis. 73 (1), 17-23 (2014).
  4. Chan, E. K., et al. Report of the First International Consensus on Standardized Nomenclature of Antinuclear Antibody HEp-2 Cell Patterns 2014-2015. Front Immunol. 6, 412 (2015).
  5. Malyavantham, K., Suresh, L. Analysis of DFS70 pattern and impact on ANA screening using a novel HEp-2 ELITE/DFS70 knockout substrate. Auto Immun Highlights. 8 (1), 3 (2017).
  6. Sperotto, F., Seguso, M., Gallo, N., Plebani, M., Zulian, F. Anti-DFS70 antibodies in healthy schoolchildren: A follow-up analysis. Autoimmun Rev. , (2017).
  7. Ayaki, M., et al. Detection of cytotoxic anti-LEDGF autoantibodies in atopic dermatitis. Autoimmunity. 35 (5), 319-327 (2002).
  8. Ochs, R. L., et al. Autoantibodies to DFS 70 kd/transcription coactivator p75 in atopic dermatitis and other conditions. J Allergy Clin Immunol. 105 (6 Pt 1), 1211-1220 (2000).
  9. Watanabe, A., et al. Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers. Arthritis Rheum. 50 (3), 892-900 (2004).
  10. Yamada, K., et al. Humoral immune response directed against LEDGF in patients with VKH. Immunol Lett. 78 (3), 161-168 (2001).
  11. Seelig, C. A., Bauer, O., Seelig, H. P. Autoantibodies Against DFS70/LEDGF Exclusion Markers for Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases (SARD). Clin Lab. 62 (4), 499-517 (2016).
  12. Ochs, R. L., et al. The significance of autoantibodies to DFS70/LEDGFp75 in health and disease: integrating basic science with clinical understanding. Clin Exp Med. 16 (3), 273-293 (2016).
  13. Bizzaro, N., et al. Specific chemoluminescence and immunoasdorption tests for anti-DFS70 antibodies avoid false positive results by indirect immunofluorescence. Clin Chim Acta. 451 (Pt B), 271-277 (2015).
  14. Bizzaro, N., et al. Antibodies to the lens and cornea in anti-DFS70-positive subjects. Ann N Y Acad Sci. 1107, 174-183 (2007).
  15. Daniels, T., et al. Antinuclear autoantibodies in prostate cancer: immunity to LEDGF/p75, a survival protein highly expressed in prostate tumors and cleaved during apoptosis. Prostate. 62 (1), 14-26 (2005).
  16. Dellavance, A., et al. The clinical spectrum of antinuclear antibodies associated with the nuclear dense fine speckled immunofluorescence pattern. J Rheumatol. 32 (11), 2144-2149 (2005).
  17. Gundin, S., et al. Measurement of anti-DFS70 antibodies in patients with ANA-associated autoimmune rheumatic diseases suspicion is cost-effective. Auto Immun Highlights. 7 (1), 10 (2016).
  18. Kang, S. Y., Lee, W. I. Clinical significance of dense fine speckled pattern in anti-nuclear antibody test using indirect immunofluorescence method. Korean J Lab Med. 29 (2), 145-151 (2009).
  19. Lee, H., Kim, Y., Han, K., Oh, E. J. Application of anti-DFS70 antibody and specific autoantibody test algorithms to patients with the dense fine speckled pattern on HEp-2 cells. Scand J Rheumatol. 45 (2), 122-128 (2016).
  20. Mariz, H. A., et al. Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody-positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases. Arthritis Rheum. 63 (1), 191-200 (2011).
  21. Marlet, J., et al. Thrombophilia Associated with Anti-DFS70 Autoantibodies. PLoS One. 10 (9), e0138671 (2015).
  22. Mercado, M. V., et al. Detection of autoantibodies to DSF70/LEDGFp75 in Mexican Hispanics using multiple complementary assay platforms. Auto Immun Highlights. 8 (1), 1 (2017).
  23. Muro, Y., Sugiura, K., Morita, Y., Tomita, Y. High concomitance of disease marker autoantibodies in anti-DFS70/LEDGF autoantibody-positive patients with autoimmune rheumatic disease. Lupus. 17 (3), 171-176 (2008).
  24. Muro, Y., Sugiura, K., Nakashima, R., Mimori, T., Akiyama, M. Low prevalence of anti-DFS70/LEDGF antibodies in patients with dermatomyositis and other systemic autoimmune rheumatic diseases. J Rheumatol. 40 (1), 92-93 (2013).
  25. Mutlu, E., Eyigor, M., Mutlu, D., Gultekin, M. Confirmation of anti-DFS70 antibodies is needed in routine clinical samples with DFS staining pattern. Cent Eur J Immunol. 41 (1), 6-11 (2016).
  26. Okamoto, M., et al. Autoantibodies to DFS70/LEDGF are increased in alopecia areata patients. J Autoimmun. 23 (3), 257-266 (2004).
  27. Pazini, A. M., Fleck, J., dos Santos, R. S., Beck, S. T. Clinical relevance and frequency of cytoplasmic and nuclear dense fine speckled patterns observed in ANA-HEp-2. Rev Bras Reumatol. 50 (6), 655-660 (2010).
  28. Schmeling, H., et al. Autoantibodies to Dense Fine Speckles in Pediatric Diseases and Controls. J Rheumatol. 42 (12), 2419-2426 (2015).
  29. Wiik, A. S., Hoier-Madsen, M., Forslid, J., Charles, P., Meyrowitsch, J. Antinuclear antibodies: a contemporary nomenclature using HEp-2 cells. J Autoimmun. 35 (3), 276-290 (2010).
  30. Mahler, M., Fritzler, M. J. The Clinical Significance of the Dense Fine Speckled Immunofluorescence Pattern on HEp-2 Cells for the Diagnosis of Systemic Autoimmune Diseases. Clin Dev Immunol. 2012, 494356 (2012).
  31. Mahler, M., et al. Anti-DFS70/LEDGF Antibodies Are More Prevalent in Healthy Individuals Compared to Patients with Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases. J Rheumatol. 39 (11), 2104-2110 (2012).
  32. Conrad, K., Rober, N., Andrade, L. E., Mahler, M. The Clinical Relevance of Anti-DFS70 Autoantibodies. Clin Rev Allergy Immunol. , (2016).
  33. Miyara, M., et al. Clinical Phenotypes of Patients with Anti-DFS70/LEDGF Antibodies in a Routine ANA Referral Cohort. Clin Dev Immunol. 2013, 703759 (2013).
  34. Bizzaro, N., Tonutti, E., Villalta, D., et al. Recognizing the dense fine speckled/lens epithelium-derived growth factor/p75 pattern on HEP-2 cells: not an easy task! Comment on the article by Mariz et al. Arthritis Rheum. 63 (12), 4036-4037 (2011).

Tags

ANA ScreeningHEp-2 ELITE/DFS70 Knockout SubstrateMonospecific DFS70 PatternMixed DFS70 PatternIndirect Immunofluorescence AssayAntinuclear AutoantibodiesHomogeneous Speckled PatternQuality ControlSubstrate Slide PreparationSample IncubationWell Cross-contaminationAutoimmune Disease

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Malyavantham, K. S., Suresh, L. Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate. J. Vis. Exp. (131), e56722, doi:10.3791/56722 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image