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Immunology and Infection

Gleichzeitige Unterscheidung der Konkurrenzsituation und gemischte DFS70 Muster bei ANA-Screening mit einem neuartigen HEp-2 ELITE/DFS70 Ko-Substrat

Published: January 17, 2018
doi:
10.3791/56722
,
1Research & Development, Immco Diagnostics,A Trinity Biotech Company

Summary

DFS70 Autoantikörper imitieren üblichen krankheitsassoziierten Antinukleäre Antikörper-Muster machen genaue Interpretation herausfordernde Verwendung konventioneller HEp-2-Substrate. Das Protokoll beschreibt die Vorteile der neuartigen technischen HEp-2-Substrat über konventionelle HEp-2 in ANA screening und DFS70 Muster mit hohem Vertrauen in Konkurrenzsituation und gemischte ANA positive Fälle zu unterscheiden.

Abstract

Systemische Autoimmunerkrankung Bindegewebserkrankungen zeichnen sich durch zirkulierende Antinukleäre Antikörper (ANA). Zwar für ANA-screening gibt es mehrere Technologien, bleibt indirekte Immunfluoreszenz (IIF) mit menschlichen epithelialen Zellen-2 (HEp-2) Substrat die primäre und empfohlene Methode wegen seiner überlegenen Empfindlichkeit. HEp-2 Substrate erkennt eine Vielzahl von Mustern aus dem Autoantikörper Bindung an verschiedenen Proteinen und Nukleinsäuren Autoantigene in den Zellkern und Zytoplasma der Zellen verteilt. Die große Vielfalt der Konkurrenzsituation und gemischte Muster durch positive Reaktionen auf HEp-2 Substrat auch erschweren die Interpretation und die Genauigkeit der Berichterstattung. Ein konkretes Beispiel, das größte Aufmerksamkeit vor kurzem erhielt ist das dichten feinen gesprenkelten 70 (DFS70) Muster aus Autoantikörper, die spezifisch an ein Protein namens Linse Epithel abgeleitet Wachstumsfaktor (LEDGF) binden. Mangel an klaren Zusammenhang eine bestimmte systemische Autoimmunerkrankung mit hoher Prävalenz in gesunden Populationen haben genaue Interpretation der DFS70 Muster wichtig. Genaue Unterscheidung der DFS70 Muster von krankheitsassoziierten Muster mit konventionellen HEp-2-Substrat ist eine Herausforderung. Darüber hinaus erschweren häufig gleichzeitige Auftreten von DFS70 Muster zusammen mit krankheitsassoziierten Muster wie homogen, gesprenkelt und gemischte homogene gesprenkelten Muster die IIF-Interpretation. Dieses Papier soll zeigen, dass das Dienstprogramm eines Romans HEp-2 IIF Substrat entwickelt, die alle Vorteile der herkömmlichen HEp-2-Substrat bewahrt und bietet gleichzeitig die Möglichkeit, DFS70 Muster mit hohem Vertrauen in diesen beiden zu unterscheiden Konkurrenzsituation und gemischte ANA positive Beispiele. Das neue Substrat kann weitere krankheitsassoziierten ANA-Muster von DFS70 Muster zuvor verborgen zu entlarven.

Introduction

ANAs sind ein Markenzeichen von Autoimmun vermittelte systemische Bindegewebe Krankheiten1. Verschiedene Methoden werden zur Überprüfung und Bestätigung der ANAs eingesetzt. IIF-Technik mit HEp-2 Substrat bleibt das am weitesten verbreitete und häufig empfohlene Methode für das screening von ANAs1,2. Trotz Fortschritten in der festen Phase diagnostischen Test Methoden wie Enzym-Assay verknüpften Immunosorbentprobe (ELISA), Enzym-Immunoassay (EIA), Chemilumineszenz-Immunoassay (CLIA) und Perle-basierte Multiplex-Assays ist IIF von HEp-2 die am weitesten verbreitete screening Methode aufgrund seiner diagnostischen Nutzen und Kosten-Effektivität-1,–2,–3. Die oben genannten Test-Technologien verlassen Sie sich auf eine begrenzte Anzahl von gereinigten Native oder rekombinanter Autoantigene während der HEp-2 Zelle Monolage Vorbereitungen auf Glas-Folie-Brunnen eine breite Palette von Autoantigene in ihrer natürlichen Form präsentieren verteilt der Zellkern und Zytoplasma, reagieren, die mit der Autoantikörper aus Patientenserum oder Positivkontrollen, was zu einer Vielzahl von Mustern, die mit verschiedenen Autoimmunerkrankungen assoziiert sind. Diese Muster sind in nuklearen und zytoplasmatischen mitotischen Muster basierend auf dem Standort des Antigens in den Zellen unterteilt. Jedes Muster und die damit verbundenen Antigen/Antigene und Krankheitszustände sind gut charakterisierten4. In der IIF-Methode sind Kontrolle und Patienten Sera auf Glas-Folie-Brunnen inkubiert, die präsentieren eine Monoschicht Kultur HEp-2 Zellen entsprechend befestigt, eine Vielzahl von Autoantigene in ihrer natürlichen Konfiguration zu erhalten. Die Autoantikörper im Patientenserum oder Positivkontrollen dürfen an die Autoantigene präsentiert von HEp-2 Zellen auf dem Substrat (Objektträger gut) während der Inkubation zu binden. Nach Inkubation, ungebundenen Antikörper werden abgewaschen und gebundenen Antikörper der Klasse IgG mit Fluorescein/Fluorescein erfolgt (FITC) konjugierte Anti-Human IgG Reagenz erkannt werden. Ungebundene berichtet-Konjugat ist weggespült und die Glasdeckgläser sind montiert auf den Folien mit einem Montage-Medium, das erhält die Reaktionen und erleichtert die Beobachtung unter dem Fluoreszenz-Mikroskop. Reaktionen beobachtet unter dem Fluoreszenzmikroskop, ausgestattet mit entsprechenden Erregung-Emission Filterkombination, die gemäß der Reporter verwendet konfiguriert ist (für FITC-Reporter, eine diagnostische Mikroskop in der Regel verwendet Filter mit Erregung Palette von 467 -498 nm und eine Emissionsbereich 513-556 nm). Die Anwesenheit von ANA zeigt eine leuchtend grüne Fluoreszenz spezifischer Strukturen in den Zellen. Im Gegensatz zu automatisierten Test-Plattformen beruht IIF Methodik auf den mühsamen Prozess der serielle Verdünnung der Sera und die visuelle positive Bestimmung der Färbung Muster erfordert bedeutende Kompetenz5,6. Trotz dieser Einschränkungen bleibt das am meisten benutzteste IIF von HEp-2 und empfohlene Methode für das Screening von ANAs aufgrund der Standardisierungsbemühungen um eine Muster-Interpretation und Nomenklatur von dem internationalen Konsens über ANA Muster (ICAP) Ausschuss, erhöhte Verfügbarkeit von Automatisierungslösungen für IIF Folie Verarbeitung und Ergebnis-Interpretation-3.

Unter der Vielzahl der Muster von HEp-2 IIF Methode, Autoantikörper, die Ausrichtung der psip1 Genprodukts (auch bezeichnet als LEDGF/p75/DFS70) erkannt, haben großes Interesse in den letzten Jahren aus mehreren Gründen4,5 ,6,7,8,9,10. DFS70 Autoantikörper sind in hohe Titer in gesunden Kontrollpersonen, und Studien haben es bisher versäumt, zeigen eine deutliche klinische Vereinigung für das Vorhandensein von DFS70 Autoantikörper7,8,9 ,10,11,12,13. Die Preise der berichteten positive Ergebnisse für DFS70 Autoantikörper in verschiedenen Krankheitszuständen und gesunde Kohorten sehr unterschiedlich zwischen Studien6,8,9,10,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Die Konkurrenzsituation DFS70 Muster ist aus einem homogenen oder gesprenkelten Muster aber Auslegung der gemischte homogene gesprenkelten Muster gut differenziert und Anti-DFS70 Antikörper auftreten zusammen mit anderen ANAs ist eine Herausforderung auch für fachkundige Leser. Die aktuelle Generation der IIF screening-Methoden und DFS70 bestimmte Festphasen-Assays sind nicht in der Lage, eine Konkurrenzsituation DFS70 Reaktion von gemischten Muster (Abbildung 1A, gelb schattierten Bereich des Algorithmus) zu unterscheiden. Fehlinterpretation von DFS70 Muster als homogene, gesprenkelt, gemischte Muster oder umgekehrt, kann schwerwiegende Auswirkungen auf die Patientenversorgung haben. Das aktuelle häufig verwendete Protokoll ist wie folgt: die klinischen Labors beschäftigen eine Vielzahl von Festphase konfirmatorische Prüfungen für krankheitsassoziierten ANAs und/oder eine Immunadsorption Methode für DFS70/LEDGF beim dichten fein (AC-2) Muster gesprenkelt steht im Verdacht (Abbildung 1a)4,5.

Das Ziel dieses Protokolls ist, demonstrieren das Dienstprogramm eines Romans entwickelt HEp-2 IIF Substrat (HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout (KO), wird als bezeichnet HEp-2 ELITE), die alle Vorteile der herkömmlichen HEp-2 für das screening von ANAs und gleichzeitig behält DFS70 Muster mit hohem Vertrauen in Konkurrenzsituation und gemischte ANA positive Fälle (Abbildung 1 b, gelb schattierten Bereich des Algorithmus)5zu unterscheiden. HEp-2 ELITE Substrat besteht aus eine ungefähre Mischung aus unveränderten konventionellen HEp-2 Zellen und veränderter Zellen frei von LEDGF/p75/DFS70 Antigen in 1:9 Verhältnis5. Die IIF-Verfahren für HEp-2 ELITE ist identisch mit der herkömmlichen Methode der HEp-2. Die einmalige Konfiguration des HEp-2 ELITE Substrat behält alle Vorteile der herkömmlichen HEp2 nicht nur sondern kann homogene, gesprenkelt und gemischte Reaktionsmuster von DFS70 Muster bei der ersten Durchsicht oder Prüfung einer Stichprobe (Abbildung 1 b unterscheiden )5. Patientenseren auf Folien mit HEp-2 IIF Substrat reagiert werden sollte verdünnten 01:40 mit screening-Verdünnung oder wie pro das individuelle Labor-Kriterium sein. Eine spezifische Reaktion bei 01:40 oder höhere Titer ist als positiv betrachtet.

In dieser Studie, positiven Seren für homogene, gesprenkelt, Zentromer, Nukleolus, zytoplasmatischen retikuläre/AMA und DFS70 Muster, die ein mittlere positives Signal (bezogen auf die negativ-Kontrolle und positiven ANA-Kontrolle zur Verfügung gestellt vom Kit) bei Vorführung produziert Verdünnung von 01:40 wurden ausgewählt für die Simulation der Mono-spezifische und gemischte Muster auf HEp-2 Substrate (konventionelle und HEp-2 ELITE). Die 01:40, die verdünnte DFS70 positive Seren mit 01:40 vermischten Muster Verdünnungen von einzelnen krankheitsassoziierten ANA Steuerelemente (homogene, gesprenkelt, Zentromer, Nukleolus, oder zytoplasmatischen retikuläre-AMA) in verschiedenen Verhältnissen (Kontrolle: DFS70 in 100:0, 80: 20, 50: 50, 20: 80 und 0:100) und auf konventionelle ausgewertet und HEp-2 ELITE Substrate nach IIF Standardverfahren unten umrissen.

Protocol

Das Protokoll folgt den Richtlinien des Trinity Biotech institutionelle Humanforschung Ethikkommission. 1. Probe und Substrataufbereitung Beutel mit Substrat Folien ermöglichen (Glas-Folien mit 12 Bohrungen auf jeder Folie, die entweder HEp2 oder HEp-2 + HEp2 KO Zelle Mischung) zu equilibrate auf Raumtemperatur für eine optimale Leistung und Kondensation von Feuchtigkeit auf der Oberfläche der Folie vor der Zugabe der Probe. Dies sollte etwa zwischen 10-15 min dauern. Sobald auf Raumtemperatur equilibriert, entfernen Sie vorsichtig die Substrat-Folien mit Fingern ohne sie berühren die Seiten des Beutels. Beschriften Sie die Folien und legen Sie sie in einer Inkubation Kammer (bei Raumtemperatur) ausgekleidet mit Papiertüchern angefeuchtet mit Wasser, um zu verhindern, Trocknung von Folien während der Probe und konjugierte Inkubation.Hinweis: Unspezifische Färbung kann aus trockenen Brunnen führen; einem feuchten Papiertuch in der Inkubation Kammer sorgt für Feuchtigkeit und verhindert auch Trockenheit. (2) Zugabe von Kontrollen und Proben Etwa 50 µL der negativ/positiv-Kontrollen, Kombinationen von DFS70-ANA-positiven Seren zu verzichten, wie in dieser Studie oder Patientenserum Proben auf einzelne Folie Brunnen beschrieben. Steuerelemente und Proben in jede Vertiefung auf der Folie zu verzichten. Um auch Cross-Kontamination zu verhindern, vermeiden Sie Überfüllung der Brunnen. Während keine Überfüllung Brunnen, vollständige Abdeckung der Oberfläche gut zu gewährleisten und Luftblasen vermeiden.Hinweis: Die empfohlene Menge ist 50 µL gemäß Schritt 2.1. Setzen Sie den Deckel auf die Inkubation Kammer und inkubieren Sie Folien für 30 min bei Raumtemperatur. Wenn ANA im Serum des Patienten vorhanden ist, wird es an der Zellen in jedem Bohrloch während dieser Inkubationszeit binden. Sobald die Inkubationszeit vorüber ist, entfernen Sie die Folie aus der Inkubation Kammer. Halten Sie die Folie am Ende der Registerkarte “und mit ca. 10 mL Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Waschpuffer im Kit enthalten, mit einer Pipette spülen Sie vorsichtig ab oder in ein Becherglas gefüllt mit PBS für 10-15 s. übertragen Sie die Folie sofort in ein Coplin Gefäß mit PBS-Waschpuffer und waschen ( Einweichen Sie) 10 min. Wiederholen Sie den Vorgang mit allen übrigen Folien.Hinweis: Beim Platzieren mehrere Folien in einem Coplin Glas, darauf achten, dass die Zelle auf der Folie nicht einer anderen Folie in Berührung kommt sonst wird eingehalten, schädigen die Zellen auf dem Objektträger. (3) Zugabe von fluoreszierenden Konjugat Entfernen Sie nur eine Folie zu einem Zeitpunkt aus dem Coplin Glas. Um die überschüssige PBS Waschpuffer aus der Folie entfernen, sanft tippen Sie oder Tupfen Sie die Folie auf dem Papierhandtuch. Jedes Kit wird mit FITC Anti-Human-IgG fluoreszierende Konjugat beschriftet geliefert. Tragen Sie an jedem Brunnen sanft 1 Tropfen (50 µL) bereitgestellten konjugiert auf. Inkubieren Sie die Folien in der geschlossenen Färbung Inkubation Kammer für 30 min.Hinweis: Die Verwendung von spezifischen IgG-Konjugat Fc wird empfohlen. Besteht ANA im Serum des Patienten vorhanden, wird das Konjugat an die Zellen in jedem Bohrloch während dieser Inkubationszeit binden, ergibt sich die spezifische Fluoreszenz von den Zellen in den Brunnen. Das Konjugat reagiert empfindlich auf Licht. Die geschlossene Inkubation Kammer hilft leichte Störungen mit den Konjugat Reaktionen der Zellen in jedem Bohrloch. Sobald die Inkubationszeit vorüber ist, entfernen Sie die Folie aus der Inkubation Kammer. Halten Sie die Folie auf der Registerkarte “Ende und spülen Sie sanft, mit ca. 10 mL PBS Waschpuffer im Kit mit einer Pipette oder in ein Becherglas gefüllt mit PBS zur Verfügung gestellt. Übertragen Sie die Folie sofort in ein Coplin Glas mit PBS-Waschpuffer und waschen (einweichen), für 10 min. Wiederholen Sie den Vorgang mit allen übrigen Folien.Hinweis: Beim Platzieren mehrere Folien in einem Coplin Glas, darauf achten, dass die Zelle auf der Folie nicht einer anderen Folie in Berührung kommt sonst wird eingehalten, schädigen die Zellen auf dem Objektträger. Ort der Deckgläsern, die in dem Kit auf einem trockenen Papiertuch bereitgestellt werden. Die Montage-Medien ist mit dem Kit bereitgestellt. Am unteren Rand der das Deckglas gelten Sie zwischen 3-4 Tropfen der Montage Medien in einer Linie. Nehmen Sie eine Folie zu einem Zeitpunkt aus der Coplin JAR-Datei mit den Waschpuffer. Zum Entfernen der überschüssigen Waschpuffer sanft tippen Sie oder Tupfen Sie die Folie auf dem Papierhandtuch. Senken Sie die Folie vorsichtig auf das Deckglas, indem man die Unterkante der Folie an den Rand des Deckglases. Dies ermöglicht die Montage Medien präsentieren auf den unteren Rand Deckglas bis zur Oberkante der Folie fließen und minimiert die Bildung von Luftblasen, die mit dem Lesen von die jede Vertiefung einer Folie stören kann.Hinweis: Minimal Druck sollte, montieren Sie die Abdeckung Folie auf der Folie verwendet werden. Jede Überdruck verursachen Seitenbewegung des Deckel rutscht. Dies kann die Monolayer-Vorbereitung der Zellen und Ergebnis Verzerrung beschädigen. Speichern Sie die Folien in der Dunkelheit bei 2 bis 8 ° C. Prüfen Sie die Folien, sobald sie montiert sind oder innerhalb von 48 h.Hinweis: Längerer Lagerung kann Verschlechterung der Muster und Fluoreszenzsignal führen. 4. Kennzeichnung der positiven und negativen Ergebnissen Zeigen Sie die Folien mit einem fluoreszierenden Mikroskop mit FITC Filter, befindet sich in einem dunklen Raum. Überprüfen Sie für bestimmte helle grüne Fluoreszenz unter dem Fluoreszenzmikroskop bei einer Vergrößerung von 200 X oder höher, um die endgültige Interpretation bezüglich Positivität und Muster. Beobachten Sie die positiven und negativen Kontrollen.Hinweis: Die Positivkontrolle erscheint hell grün fluoreszieren im Zellkern (Abb. 2A, homogene). Die negative Kontrolle zeigt keine spezifische grüne Fluoreszenz unter dem Fluoreszenzmikroskop. Dokumentieren Sie das positiv/negativ-Ergebnis für jede Vertiefung und beinhalten Sie das ANA-Muster für positive Fälle.

Representative Results

HEp-2 ELITE/DFS70 KO-Substrat bewahrt klassische ANA-Muster und erleichtert die klare Unterscheidung der DFS70 Muster: Konventionelle und veränderte Zellen auf HEp-2 ELITE/DFS70 KO-Substrat sind identisch, erhalten alle Autoantigene mit Ausnahme der LEDGF/p75. Die negative-Kontrolle zur Verfügung gestellt vom Kit schafft das Fluoreszenzsignal Grundlinie. Positivkontrollen für homogene, gesprenkelt, Zentromer Nukleolus und mitochondriale Muster auf HEp-2 ELITE ergeben eine Muster identisch mit erwarteten Muster auf konventionellen HEp-2 IIF Substrat (Abbildung 2A). Diese Referenzmuster haben ausführlich zusammen mit jedem Muster Antigen und Krankheit Verband zuvor4,29. Eine kurze Beschreibung der Muster in Abbildung 2A beobachtet sind gemäß Tabelle 1. DFS70 Muster auf HEp-2 ELITE: Etwa 10 % der Zellen in jedem zeigen auch ein dichtes feines gesprenkeltes Muster (ICAP zugewiesen Nomenklatur: AC-2), die beobachtet werden, auf die Interphase Nucleus und Chromatin verbunden Färbung auf mitotischen Kerne (Abbildung 2 b) zu sehen ist. Auf einem herkömmlichen HEp-2-Substrat werden alle Zellen dieses Musters, wenn mit einer DFS70 positiven Probe reagiert haben. Die restliche ca. 90 % der HEp-2 Zellen haben die psip1 gen der LEDGF Antigens ausgeschlagen und wird daher nicht produzieren ein Signal oder ein Muster als mit einem monospezifischen DFS70 positive Serum (Abb. 2 b) reagiert. Wenn 10 % der HEp-2 Zellen heller Fluoreszenz entspricht die DFS70 Muster und der Rest der Zellen vorhanden weitere Muster (z. B. fein gesprenkelt oder Nukleolus) haben, dann zeigt dies das Vorhandensein von gemischten Muster. Genauerer Betrachtung solcher Muster unbedingt alle Autoantikörper Besonderheiten zu bestätigen, die neben dem DFS70-Muster auch vorhanden sind. Demonstrieren die Leistungsfähigkeit des HEp-2 ELITE Substrat, ein Gremium von Sera Proben entstand mit verschiedenen Konzentrationen von DFS70 und ANA positiv Sera zu kontrollieren und auf konventionelle getestet und HEp-2 ELITE Substrate mit einem standard IIF-Protokoll (Abbildung 3 , Abb. 4, Abb. 5, Abb. 6, Abbildung 7). Interpretation der DFS70 Konkurrenzsituation und gemischte Reaktionen auf konventionellen und HEp-2 ELITE Substraten: Für jedes spezifische krankheitsassoziierten ANA-Muster (Abbildung 3 Abbildung 4, Abb. 5, Abbildung 6, Bild 7), eine Konkurrenzsituation ANA Muster auf links die meisten Spalte und eine Konkurrenzsituation DFS70 Muster auf der rechten Seite die meisten Spalte kann beobachtet werden. Die drei Säulen in der Mitte stehen verschiedene Verhältnisse von krankheitsassoziierten und DFS70 Muster Positivkontrollen. Die daraus resultierende gemischte Muster sind eine Herausforderung, um auf konventionelle HEp-2-Substrat (Abbildung 3, Abbildung 4, Abb. 5, Abbildung 6, Abbildung 7, oberste Zeile) zu erkennen. Allerdings unterscheidet sich mit dem neuartigen Hep-2 ELITE Substrat, in den meisten der Proben, die Differenz der Intensitäten zwischen unveränderten und veränderter Zellen die bestätigt nicht nur der Anwesenheit von DFS70 Autoantikörper (wenn das Verhältnis von heller, weniger hellen Zellen ist 1:9), sondern zeigt auch eine sekundäre ANA-Muster. Bei homogenen DFS70 oder gesprenkelt DFS70 gemischte Reaktionen ist es unmöglich vorherzusagen getrost das richtige Muster führt zu den Übungseinheiten entscheiden sich für eine Reihe von zusätzlichen Tests (Abbildung 1A) laufen. Im Falle von Zentromer-DFS70 und Nukleolus DFS70 gemischte Reaktionen, zu ahnen, dass DFS70 Positivität sehr anspruchsvoll ist (Abbildung 5, Abbildung 6). Mit Nukleolus und zytoplasmatischen retikuläre/AMA Reaktionen ist das DFS70-Muster nicht dominant, bis das Sera Verhältnis 50 % erreicht. In allen Beispielen kann HEp-2 ELITE Substrat das DFS70 Muster und der zugrunde liegenden sekundären Muster über ein breiteres Spektrum an Intensität Ebenen und erleichtert somit eine genauere ANA-Interpretation. Um genau zu beobachten, die gemischte Muster, Ergebnisse von 50: 50 Kombinationen von ANA und DFS70 positive Kontrollen erweiterten (Abbildung 8) für konventionelle und HEp-2 ELITE Substrate waren. Es wird empfohlen, sowohl die Interphase und mitotischen Färbung für alle ANA-Muster einschließlich DFS70 auf HEp-2 Substrate zur Verbesserung der Auslegung und die Genauigkeit der berichteten Muster zu beobachten. Jedoch kann für gemischte Muster, das differenzierte Muster präsentiert dividiert Zellkerne nicht genaue Interpretation zu erleichtern ausreichen. Rote Pfeile (Abbildung 8) zeigen die mitotische Kerne in konventionellen und veränderter Zelle. Es ist festzustellen, dass gemischt, die DFS70 Reaktionen auf teilenden Zellen nicht entsprechen, mit den festgelegten Regeln für die Auslegung der krankheitsassoziierten ANA Muster. Gelbe und blaue Pfeile zeigen bzw. unveränderten und technisierten HEp-2 (DFS70 KO) Zellkerne. In allen Kombinationen (Abbildung 8), ein klare Intensität Unterschied zwischen der unveränderten Zelle Atomkraft Färbung (~ 10 %) und veränderter nuklearen (~ 90 %) Zellmuster im gleichen mikroskopische Blickfeld eingehalten wird, ermöglicht die gleichzeitige Vorführung und Bestätigung der DFS70 Muster. Abbildung 1: ANA screening-Algorithmen, die konventionellen Methoden der HEp-2 und HEp-2 ELITE/DFS70 KO IIF. (A) Schaltplan entwirrt den Mangel an herkömmlichen HEp-2 IIF monospezifischen und gemischte DFS70 positive Muster bei der Screening-Phase (gelb schattierten Bereich) zu identifizieren und seine Unfähigkeit, eine sekundäre krankheitsassoziierten auszuschließen ANA-Muster, die möglicherweise verschwiegen Sie durch DFS70 Muster werden. Ferner ist die aktuelle Generation der DFS70 bestimmte feste Phase, die bestätigende Assays können nicht monospezifischen DFS70 Positivität bestätigen die führt zu zusätzlichen bestätigende Prüfung für ANAs. (B) Schaltplan zeigt die Fähigkeiten von HEp-2 ELITE für das Screening von ANAs, gleichzeitige Unterscheidung der Konkurrenzsituation und DFS70 Unruhe, und wodurch die Notwendigkeit für feste Phase DFS70 Bestätigung assays. Algorithmus mit HEp-2 ELITE deutlich vereinfacht das ANA-screening und reduziert die erforderliche Anzahl von Bestätigung Assays. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: Classic ANA und DFS70 Muster auf HEp-2 ELITE/DFS70 KO Substrat. (A) HEp-2 ELITE/DFS70 KO-Substrat bewahrt klassische ANA-Muster. Klassische homogene Reaktions- und DFS70 positive Reaktionen wurden mit den positiven Kontrollen durch das Kit erstellt. Andere Reaktionen wurden mit vorher festgelegten Positivkontrolle Sera für gesprenkelt, Zentromer, Nukleolus und zytoplasmatischen retikuläre/AMA Reaktionen5hergestellt. (B) HEp-2 ELITE/DFS70 KO-Substrat bietet sowohl konventionelle als auch veränderte Zellen erleichtert einfachen Unterscheidung von DFS70 Muster. Schaltplan zeigt die resultierende DFS70 monospezifischen Reaktion und die Färbung Muster auf Interphase und Zellkerne für konventionelle und veränderter (DFS70-KO) Zellen aufteilen. Veränderte HEp-2 Zellen sind frei von LEDGF/p75/DFS70-Antigen ermöglicht die simultane Detektion von sekundären Muster, die in der Regel durch DFS70 Autoantikörper Reaktion auf konventionellen HEp-2-Substraten verborgen sind. Pfeile (gelb) zeigen Beispiele der mitotischen Zellkerne. Maßstabsleisten repräsentieren 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3: DFS70 und homogene Sera in Kombination. DFS70 monospezifischen Sera wurden in Kombination mit einer positiven homogene Mustersteuerung in verschiedenen Verhältnissen (100:0, 80: 20, 50: 50, 20: 80 und 0:100) und auf konventionellen und technisierten HEp-2 (DFS70 KO) Substraten getestet. Maßstabsleisten repräsentieren 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4: DFS70 und Sera in Kombination gesprenkelt. DFS70 monospezifischen Sera wurden kombiniert mit einer positiven gesprenkelten Mustersteuerung in verschiedenen Verhältnissen (100:0, 80: 20, 50: 50, 20: 80 und 0:100) und auf konventionellen und technisierten HEp-2 (DFS70 KO) Substrate getestet. Maßstabsleisten repräsentieren 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 5: DFS70 und Zentromer Sera in Kombination. DFS-70 monospezifischen Sera wurden kombiniert mit einem positiven Zentromer Mustersteuerung in verschiedenen Verhältnissen (100:0, 80: 20, 50: 50, 20: 80 und 0:100) und auf konventionellen und technisierten HEp-2 (DFS70 KO) Substrate getestet. Maßstabsleisten repräsentieren 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 6: DFS70 und Nukleolus Sera in Kombination. DFS-70 monospezifischen Sera wurden kombiniert mit einem positiven Nukleolus Mustersteuerung in verschiedenen Verhältnissen (100:0, 80: 20, 50: 50, 20: 80 und 0:100) und auf konventionellen und technisierten HEp-2 (DFS70 KO) Substrate getestet. Maßstabsleisten repräsentieren 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 7: DFS70 und zytoplasmatischen retikuläre/AMA Sera in Kombination. DFS70 monospezifischen Sera wurden in Kombination mit einem positiven mitochondriale Mustersteuerung in verschiedenen Verhältnissen (100:0, 80: 20, 50: 50, 20: 80 und 0:100) und auf konventionellen und technisierten HEp-2 (DFS70 KO) Substraten getestet. Maßstabsleisten repräsentieren 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 8: Muster (50: 50-Verhältnis) auf konventionellen produziert gemischt und HEp-2 ELITE Substrate. Unterschiede zwischen den beiden Substraten werden aufgedeckt. Rote Pfeile zeigen die mitotische Kerne in konventionellen und veränderter Zellen auf beiden Substraten. Für diese Kombinationen ist das Differentiale Muster präsentiert dividiert Zellkerne auf konventionellen HEp-2-Substrat nicht ausreichend für genaue Interpretation der gemischten Muster. Es ist festzustellen, dass gemischte DFS70 Reaktionen auf teilender Zellen, die festgelegten Regeln für die Auslegung der krankheitsassoziierten ANA Muster durcheinanderbringen können. Gelbe und blaue Pfeile zeigen bzw. unveränderten und technisierten HEp-2 (DFS70 KO) Zellkerne. Ergebnisse für alle Kombinationen getestet auf dem Substrat entwickelt: ein klare Intensität Unterschied zwischen der Interphase nuklearen Muster Zugehörigkeit zu unveränderten Zellen (~ 10 %) und veränderte Zellen (~ 90 %) beobachtet wurde, die es ermöglicht gleichzeitige Feststellung und Bestätigung der DFS70 Muster. Maßstabsleisten repräsentieren 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. ANA-Muster Beschreibung Homogene Der gesamte Kern fluoresziert gleichmäßig mit einem diffusen Färbung Muster. Gesprenkelt Diskrete, groben Flecken von feinen fluoreszieren in den Zellkern.  Feine gesprenkelt und grob gesprenkelten Muster sind beschrieben worden. Nukleolus Die Nukleolen Fleck als mehrere feste oder gesprenkelten Körper innerhalb des Zellkerns. Subtypen wurden bisher beschrieben. Zentromer Große Flecken von endlichen. Reaktive Antigen segregiert mit kondensierten Chromosomen in den Zellen in der Mitose. Zytoplasmatischen retikuläre/AMA Das Zytoplasma erscheint körnig mit positive Färbung der Mitochondrien. DFS70 •Conventional HEp-2 Zellen: ein dichtes feines gesprenkeltes Muster beobachtet die Interphase Nucleus und Chromatin verbunden Färbung auf mitotischen Kerne zu sehen ist. •Engineered DFS70 KO Zellen: Anti-DFS70 Antikörper produzieren negative Färbung HEp-2 Elite / DFS70 KO konventionelle und veränderte (DFS70 KO) Zellen in etwa 1:9 Verhältnis hat. Konventionellen Zellen produzieren typische DFS70 Muster und veränderte Zellen produzieren eine negative Muster wenn reagierte mit einem DFS70 monospezifischen/isolierte positive Reaktionen. Tabelle 1: Beschreibung der ANA-Muster.

Discussion

Autoantikörper, nukleare und zytoplasmatischen Antigenen sind weit verbreitet in systemischen Autoimmunerkrankungen. Zwar keinen einzigen Test die beste mögliche Sensitivität und Spezifität bietet, IIF von HEp-2 eine hochempfindliche und kostengünstige Screening-Methode für systemische Autoimmunerkrankungen,2,3,4 gilt als . Trotz der Prävalenz der IIF-Protokoll seit mehr als 50 Jahren ist die Genauigkeit der IIF-Assay stark abhängig von den Fähigkeiten des Technikers, sorgfältige Ausführung der einzelnen Schritte des Protokolls und genaue Interpretation der Ergebnisse mit einem gepflegten Fluoreszenzmikroskop. Diagnose der systemische Autoimmunerkrankung sollte nicht auf die Ergebnisse eines einzelnen serologische Tests wie IIF von HEp-2 beruhen.

Rekonstitution der Reagenzien mit hoher Qualität Wasser (destilliert/entionisiertem), Verwendung von standardisierten Kit-Komponenten (Folien mit HEp-2 Zelle Monolagen Probe Verdünnungsmittel, positive und negative Kontrollen, vorverdünnt optimierte FITC-Konjugat und Eindeckmittel) haben Sie einen positiven Einfluss auf die Ergebnisse. Überspringen das Hinzufügen von Steuerelementen oder Proben auf Brunnen kann falsche negative Interpretationen fördern. Trocknen von Folien zu jedem Zeitpunkt nach die Zugabe von Probe oder Kontrolle Serums falsch positive Reaktionen und/oder falsche Muster führen kann. Zuviel Waschpuffer links auf Folie oder Trocknung von Folie Brunnen vor der Dispens Eindeckmedium Artefakte führen kann. Unzureichende Menge von Montage Medium oder erzeugen Bläschen an der Oberfläche der Folie vor dem Einbau ein Deckglas führt zu Reaktionen, die aussehen, verschwommen oder unscharf, wenn Sie unter dem Mikroskop beobachtet. Gerahmte Dias müssen bei 2 bis 8 ° C gelagert und analysiert in der empfohlenen Zeitfenster zu falsch negativen oder Serums Ergebnisse zu minimieren.

Mit einem gepflegten Epi-fluoreszierende Mikroskop beherbergt eine entsprechende LED/Hg/Xenon-Lichtquelle und saubere optische Komponenten einschließlich der Anregung und Emission Filter, die nicht beschädigt sind, ist entscheidend für genaue IIF Ergebnisse zu erhalten. Schulungen für anspruchsvolle positiver/negativer Reaktion Intensitäten und Interpretation von Mustern für Endbenutzer ist von entscheidender Bedeutung. HEp-2 IIF-Assays sind anfällig für fehlende Standardisierung im Verfahren, Mikroskopkonfiguration und Endbenutzerschulungen oder Geschicklichkeit. Der Konsens Nomenklatur und Vertreter Muster und Beispiele für Bilder aufgenommen mit verschiedenen Herstellern werden von ICAP zur Verfügung gestellt () für pädagogische Zwecke4. Ein HEp-2 Zelle Muster Klassifikationsbaum zur Verfügung gestellt von ICAP nach verschiedenen atomaren, cytoplasmatische und mitotischen Mustern ist eine wertvolle Ressource, die feinen Unterschiede zwischen verschiedenen Mustern zu lernen, die ähnlich wie die ungeschulten Augen4aussehen kann. Eines der wichtigsten Beispiele eines anspruchsvollen Musters ist die DFS70, die auch eine eindeutige Assoziation mit einer Autoimmunerkrankung fehlt, und wie in den vorherigen Abschnitten erörtert dieses Muster ist sehr weit verbreitet in gesunden Populationen5.

Je nach Studie die Prävalenz von Anti-DFS70-Autoantikörper variieren zwischen gesunden Kohorten, ANA Screening Populationen und ANA positive Individuen ohne Anzeichen von systemische Autoimmunerkrankung9,16,20 ,30,31. DFS70-Autoantikörper haben gemeldet, isoliert sowie mit anderen krankheitsassoziierten ANA Mustern auftreten. Isoliert oder monospezifischen DFS70 Muster wird in 2-22 % der gesunden Kontrollpersonen, sondern in weniger als 1 % der Fälle mit rheumatischen Autoimmunerkrankung32berichtet. Basierend auf diese Trends, DFS70 Mono-Positive Muster als Kriterium bei autoimmunen rheumatischen Erkrankungen auszuschließen ICAP Ausschuss3,31,32schlug. Der ICAP-Ausschuss zur Förderung der Harmonisierung der Autoantikörper-Test-Nomenklatur und Interpretation der Ergebnisse HEp-2 IIF, empfiehlt Berichterstattung DFS70 Positivität beim ANA melden screening Ergebnisse4.

Vor Ausschluss eine systemische Autoimmunerkrankung, basierend auf DFS70 Mono-Positivität, ist es wichtig, den Status der aktuellen Überprüfung und Bestätigung Methoden (vor allem die spezifisch für DFS70) prüfen. Vereinbarung zwischen DFS70 Positivität von HEp-2 IIF und Festphase bestätigende Assays nämlich ELISA, CLIA und Linie Immunoassay/Dot-Blot Methoden) sehr unterschiedlich zwischen verschiedenen Studien13,22,25,33 . IIF Interpretation und bestätigende Assay, die Parameter, die dazu, diese Meinungsverschiedenheit beitragen gewesen besprochenen5,13,34. Ein vor kurzem vorgeschlagenen Immunadsorption Ansatz für Anti-DFS70 Antikörper Bestätigung behandelt einige der Mängel der gegenwärtigen Festphasen-Assays (z. DFS70) aber erfordert die Labs, einen weiteren Schritt in IIF Verfahren auf verdächtige Proben durchzuführen, erhöht die Kosten und Turnaround-Zeit für die Berichterstattung der Ergebnisse13. Dieser zusätzliche Schritt ist nicht erforderlich, wenn Zellen HEp-2 ELITE/DFS70 KO für Routine ANA-Screening verwendet werden. Dies reduziert die Gesamtkosten und darüber gibt es keine Auswirkungen auf die Turnaround-Zeit, da DFS70 Muster in die ersten Screening erkannt ist Schritt27. Ein weiterer Nachteil der Verwendung von herkömmlichen HEp-2 IIF-Methode ist, dass es nicht in der Lage, DFS70 Muster zusammen mit anderen ANA Muster an auftretenden der Screening-Phase zu unterscheiden. Dieser Nachteil wird jedoch durch den Einsatz von HEp-2 ELITE/DFS70 KO Zellen27überwunden.

Vergleichende Bewertung der konventionellen HEp-2 und die neue veränderter HEp-2 (HEp-2 ELITE/DFS70 KO) mit ANA Positivkontrollen und deren Kombinationen mit einem Mono-positiven DFS70 zu demonstrieren das Dienstprogramm für das neue Substrat Fähigkeit, gleichzeitig Bildschirm für ANAs und bestätigen DFS70 Muster (Abbildung 1). Die IIF-Protokoll für das neue Substrat ist identisch mit der herkömmlichen Methode der HEp-2 IIF. Interpretationsschema für alle krankheitsassoziierten ANA-Muster ist identisch mit Ausnahme der DFS70-Muster (Tabelle 1). Interpretation der Mono-positiv und gemischte DFS70 Muster war relativ einfacher mit der neuen Methode und es rechtfertigt nicht zusätzliche Assays (Abbildung 1 b). Implementierung dieser neuen Methode im klinischen Labor die Herausforderung bei der Interpretation der DFS70 Muster vereinfacht und verbessert die Genauigkeit der Abschirmung durch weitere enthüllt krankheitsassoziierten ANA Muster zuvor verdeckt von ANA DFS70 (gemischte Muster).

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Andrew Zenger für IIF experimentieren und Sammelbilder.

Materials

HEp-2 ELITE / DFS70-KO 12 Well Slide sealed individually in pouch Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240
ANA positive control Trinity Biotech  part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
DFS70 antibody positive control Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240
Negative control Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Anti-human IgG FITC conjugate containing Evan's blue counterstain Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Buffer diluent for serum Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Phosphate buffered saline (PBS) Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Mounting medium Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Coverslips  Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
ImmuGlo ANA HEp-2 Cells 12 well slide sealed individually in pouch Trinity Biotech part of kit# 1103, 1103-240
Name Company Catalog Number Comments
Materials used in the study but not provided by the kits
Diagnostic fluorescent microscope Nikon Eclipse 50i Equipped with a spot dignostic camera, model 2.2.1
Incubation chamber Trinity Biotech provided for customers (no catalog #)
Coplin jar n/a General labware
Paper towels n/a General lab supplies
distilled/deionized water n/a General lab supplies
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References

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ANA ScreeningHEp-2 ELITE/DFS70 Knockout SubstrateMonospecific DFS70 PatternMixed DFS70 PatternIndirect Immunofluorescence AssayAntinuclear AutoantibodiesHomogeneous Speckled PatternQuality ControlSubstrate Slide PreparationSample IncubationWell Cross-contaminationAutoimmune Disease

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Malyavantham, K. S., Suresh, L. Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate. J. Vis. Exp. (131), e56722, doi:10.3791/56722 (2018).
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