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Immunology and Infection

Stenose der minderwertigen Vena Cava: ein Mausmodell der tiefen Venenthrombose

Published: December 22, 2017
doi:
10.3791/56697
,
1Institute of Cardiovascular Sciences, College of Medical and Dental Sciences,University of Birmingham

Summary

Wir beschreiben hier Stenose in der minderwertigen Vena Cava als ein Mausmodell der tiefen Venenthrombose. Dieses Modell rekapituliert Blut fließen Einschränkung, einer der wichtigsten Auslöser von venösen Thrombosen in den Menschen.

Abstract

Tiefe Venen Thrombose (TVT) und seine verheerenden Komplikationen, Lungenembolie, sind schwere gesundheitliche Problem mit hoher Sterblichkeit. Mechanismen der Thrombusbildung in Adern bleiben dunkel. Mangelnde Mobilität (z. B.nach einer Operation oder Langstreckenflüge) ist einer der wichtigsten Faktoren führt zu DVT. Die pathophysiologische Folge der mangelnden Mobilität ist Blut fließen Stagnation der Venenklappen. Hier wird ein Modell beschrieben, das solche Strömung Störung als Thrombose-treibende Faktor nachahmt. In diesem Modell entsteht Teilstrom Einschränkung (Stenose) in der unteren Hohlvene (IVC). Schließung von etwa 90 % der IVC Lumen für 48 h ergibt sich in der Entwicklung von Thromben strukturell ähnlich wie beim Menschen. Die Ähnlichkeiten sind: (i) die meisten der Thrombus Volumen ist rot, d. h. besteht aus roten Blutkörperchen und Fibrin, Ii) das Vorhandensein eines weißen Teils (Zeilen Zahn), Iii) nicht entblößt endotheliale Monolage, iv) erhöhter D-Dimer-Plasmaspiegel und V) die Möglichkeit, zu verhindern Thrombose durch niedermolekularen Heparin. Einschränkungen beinhalten Variable Größe von Thromben und die Tatsache, dass ein bestimmter Prozentsatz von Wildtyp Mäusen (0 – 35 %) produzieren vielleicht keinen Thrombus. Neben der visuellen Beobachtung und Messung können Thromben durch nicht-invasive Technologien, wie z. B. Sonographie, sichtbar gemacht werden die für die Überwachung der Dynamik der Thrombus Entwicklung ermöglicht. In kürzer Zeitpunkte (1-6 h), intravitalen Mikroskopie kann angewendet werden, um Ereignisse (z.B. Einstellung von Zellen in der Gefäßwand) direkt beobachten vor Thrombusbildung. Verwendung dieser Methode von mehreren Teams auf der ganzen Welt machte es möglich, grundlegende Mechanismen der DVT-Initiation zu entdecken und identifizieren mögliche Ziele, die für die Prävention von Vorteil sein könnte.

Introduction

Tiefe Venenthrombose (DVT) ist die Entwicklung von Thromben in den tiefen Venen in der Regel (aber nicht nur) in Beinen. In Konjunktionen mit Lungenembolie (PE; gekennzeichnet zusammen als Venöse Thromboembolien, VTE) jährlich rund 900.000 Amerikanern entwickelt und stellt ein ernstes Gesundheitsproblem und wirtschaftliche Problem1,2. PE, eine Komplikation der Thrombose, tritt auf, wenn ein Thrombus losgelöst von seiner ursprünglichen Lage wird und erreicht die Lunge, die respiratorische Insuffizienz und zum Tod führen können. Die Zahl der Todesopfer von VTE überschreitet Sterblichkeit an AIDS, Brustkrebs Krebs und Verkehrsunfälle, kombinierte3.

Der wichtigste Faktor verursacht DVT neben ist bekannt Gründe, wie Krebs oder Trauma, der Mangel an Mobilität 4,5. Dadurch kann von Chirurgie (vor allem orthopädische), Lähmungen, Langstrecken-Flügen oder aus anderen Gründen. Blutfluss in den Venen hängt die Muskelpumpe und daher Gliedmaßen Ruhigstellung Ergebnisse in stehendes Blut fließen in Venenklappen, führt zu Thrombose. Die hier beschriebene Methode soll solche Blut fließen Verzerrung6,7zu rekapitulieren. Teilstrom-Einschränkung in der unteren Hohlvene (IVC) imitiert Bedingungen im menschlichen Venenklappen und führt zur Bildung eines Thrombus in der Struktur ähnlich wie menschliche Thromben6erstellt. Der Großteil der einen Thrombus ist rot und besteht aus roten Blutkörperchen, Fibrin und Einbeziehung der Blutplättchen. Thromben haben eine kleine “weiße Teil” bereichert in Thrombozyten (Abbildung 1), die “Lines of Zahn” in menschlichen venösen Thromben beschriebenen ähneln. Beide Teile von den Thrombus enthalten auch Neutrophile8, die gehören zu den ersten Zellen am Ort der zukünftigen Thrombus6,9eingestellt werden. Neutrophilen Granulozyten in den roten Bereich zu vertreiben Neutrophilenzahl extrazelluläre Traps (NETs), während neutrophilen Granulozyten in den weißen Teil scheinen Netze8sein. In ähnlicher Weise zu menschlichen DVT, Thrombose in den Mäusen erhöhter D-Dimer-Plasmaspiegel (Abbildung 2) begleitet. Niedermolekularen Heparin (Enoxaparin), verwendet für TVT-Prophylaxe bei Patienten, verhindert auch Thrombosen bei Mäusen. Ein wichtiger Vorteil dieser Methode ist Abwesenheit von endothelialen Denudation9, charakteristisch für menschliche DVT-10. Diese Eigenschaft macht IVC Stenose mehr klinisch relevante Modellcharakter für die DVT als beispielsweise Induktion von Thrombosen durch Eisenchlorid, induziert die endotheliale Denudation und in denen Thromben bestehen vorwiegend aus Thrombozyten11, 12,13. Ein Modell der kompletten Stillstand in der IVC wird von mehreren Teams14,15,16bevorzugt. Im Gegensatz zur Stenose, in dem Restvolumenstrom in das Gefäß gehalten wird Anwendung der Stasis vollständig stoppt der Wasserfluss und schränkt damit die Zugänglichkeit der systemisch verabreichten Stoffe, die Thrombose-Website. Auch, es scheint, dass die Mechanismen, die Thrombosen induziert durch Stenose und Stasis unterscheiden: Stenose führt zu die Entwicklung der lokalen Entzündung (Aktivierung des Endothels, Freisetzung von Weibel-Palade Körperinhalt, Rekrutierung von Immunzellen und Thrombozyten an die Gefäßwand) verursacht “Immunothrombosis”6,9,17, Stase erscheint eher Thrombose induzieren vor allem auf Gewebe Faktor und andere Koagulation beruht und Fibrinolyse-bezogene Mechanismen18,19,20. Somit reflektieren die Stenose und Stasis Modelle leicht unterschiedliche Aspekte der venösen Thrombus Entwicklung, obwohl ihre Mechanismen sicherlich überschneiden können. Elektrolytische IVC-Modell (EIM) von DVT21,22 induziert einen Thrombus nur teilweise Verschließen der Gefäßwand. Daher ist es praktisch für die Prüfung der Auswirkungen der systemischen Verabreichung von verschiedenen Medikamenten auf Thrombus Wachstum. Dieses Modell übernimmt jedoch Störungen der IVC Wand Integrität (Einfügung einer Nadel) und Induktion von Thrombosen durch elektrischen Strom macht die pathophysiologische Relevanz dieses Mechanismus zumindest fragwürdig.

Protocol

Alle tierische Verfahren wurden von Animal Welfare ethische Review Body und das britische Innenministerium (UK, Projekt Lizenz 40/3745) genehmigt. Mäuse auf C57BL/6 Hintergrund, 8-12 Wochen alt, 19-25 g Körpergewicht beider Geschlechter dienen. 1. Tier Anästhesie Legen Sie eine Maus in eine Induktion Kammer und induzieren Sie Anästhesie durch eine Mischung von 5 % Isofluran mit 100 % Sauerstoff zu. Verwendung eine Fließgeschwindigkeit von 0,5 L/min. warten, bis die Maus komplett nicht mehr bewegt und von der Häufigkeit der Atmung wird selten. Entfernen Sie die Maus aus der Kammer und Rasieren Sie den Bauch mit einer elektrischen Haarschneidemaschine. Entfernen Sie Haare aus dem Bauch so gründlich wie möglich zur Vermeidung von Kontaminationen im Bauchraum. Platzieren Sie den Mauszeiger in die Rückenlage und platzieren Sie der Maus Nase in einen Kegel mit der Anästhesiesystem verbunden. Verringern Sie den Prozentsatz der Isofluran auf 2-3 % (die genaue Prozent können von Tier zu Tier abweichen). Stellen Sie sicher, dass das Tier mit seiner Atemfrequenz niedriger als üblich, aber vermeiden keuchend schläft. Tritt nach Luft schnappen, verringern Sie den Prozentsatz der Isofluran um 0,5 %. Überprüfen Sie das Pedale Reflex um richtige Anesthetization bestätigen und Operation zu starten, nur wenn es negativ ist. Wenden Sie Tierarzt Salbe auf die Augen, um Trockenheit zu verhindern. Wenden Sie eine Anti-bakterizide Lösung (1 % Hibitane) auf der Maus Bauch und wischen Sie die Fläche mit einem sterilen Baumwolle Knospe in einer Weise ausgenommen mögliche erneute Kontamination an der Operationsstelle (z.B., innen nach außen ein kreisförmig). Wiederholen Sie 3 Mal. 2. Anwendung der IVC Stenose und Maus Erholung Hinweis: Alle Instrumente sowie als Materialien (Wattestäbchen, Gaze, Kochsalzlösung usw.) kommen in Kontakt mit den OP-Bereich muss steril sein. Der Betreiber muss scheuern sich vor der Operation und sterile Handschuhe und Kleid während des Verfahrens zu tragen. Mikroskop-Griffe sollte in einer sterilen Folie umwickelt werden. Geben Sie Mäuse eine Anti-Schmerz-Behandlung vor der Operation und während der gesamten Probezeit. Z. B. Buprenorphin 0,1 mg/kg subkutan 30 min vor der Operation und dann alle 12 Stunden, bis das Tier eingeschläfert wird. Als Thrombose in dieser Methode ähnlich, sterile Entzündung entwickelt, vermeiden Sie die Verwendung von Anti-inflammatory Drogen als eine Prämedikation. Decken Sie die Maus mit einem sterilen Tuch ab und machen Sie ein Loch in den Faltenwurf, die Website der Chirurgie verfügbar zu machen. Mit Schere, machen Sie einen Schnitt entlang der Abdominal-Midline, 1,5 cm nach unten aus dem Brustbein. Mit Wattestäbchen exteriorize den Darm auf der linken Seite der Maus und bedecken Sie sie mit steriler Gaze getränkt in warmen (37 ° C) Kochsalzlösung um Austrocknen zu vermeiden. Identifizieren Sie die IVC und seiner Seitenäste (möglicherweise 0, 1 oder 2 von ihnen) in die kaudalen Richtung von der Website der Fusion von der IVC mit der linken Nieren Ader. Verbinden Sie alle sichtbaren Seitenäste mit 7: 0 inert Prolene Fäden als in der Nähe der IVC wie möglich. Versuchen Sie nicht, die Seitenäste mit der Zange direkt, sondern vielmehr sie hochziehen, das Fettgewebe umgibt sie mit einer Pinzette in der Hand halten und machen einen Tunnel unter der Verzweigung mit der Pinzette in der anderen Hand halten. Schließen Sie nicht die hinteren Zweige. Sie umgebenden Gewebe mit Zange halten, ziehen Sie die IVC oben und links erzeugen Spannung in dem kleinen Bereich zwischen den IVC und die Aorta genau in den Winkel zwischen der IVC und die linken Nieren-Ader. Berücksichtigen Sie, dass es praktisch unmöglich, die Aorta von IVC noch 2-3 mm unterhalb (in Richtung kaudalen) zu trennen. Verwenden unterschiedliche Bewegungen mit Zange Tipps in Ihrer rechten Hand machen ein Loch zwischen der Aorta und der IVC. Denken Sie daran, dass die weitere Bewegungen gemacht, desto höheren ist den Chance das Schiff zu beschädigen. Im Idealfall versuchen Sie, die Zahl der Flugbewegungen auf 3-5 zu minimieren. Bereiten Sie ein Blatt 7-0 inert Prolene Faden von etwa 2 cm lang. Legen Sie sie in der Maus Bauchhöhle linksseitig des Betreibers in der Nähe der IVC. Ziehen Sie die IVC oben und links wieder ein. Legen Sie Ihre richtige Zange Tipps in das Loch zwischen der Aorta und der IVC, so dass die Spitzen auf der anderen Seite von der IVC erscheinen. Nehmen Sie die Naht und ziehen Sie es wieder durch das Loch(Abbildung 3). Machen Sie einen vorläufigen Knoten mit der Naht aber nicht schließen. Platzieren Sie 30G Nadel (“Spacer”) in den Knoten als Haken gebogen und jetzt schließen Sie (Abb. 3B). Entfernen Sie das Distanzstück (Abb. 3C). Den Darm zurück in die Bauchhöhle mit einem Baumwoll Knospe und verteilen sie gleichmäßig darin zurück. Peritoneum mit 6-0 Vicryl Naht mit Endlosschleifen zu schließen. Schließen Sie die ersten und letzten Schleifen als einen Knoten. Enge Haut mit Metall-Klammern. Die Maus mit 0,5 mL Warm (37 ° C) zu injizieren Glukose Kochsalzlösung subkutan, das flüssige Gleichgewicht des Organismus wiederherzustellen. Platzieren Sie den Mauszeiger in einen einzelnen Käfig Warm (25 ° C) Kammer oder Zimmern und Speisen und gel Wasser in den Käfig. Beobachten Sie, bis die Maus (in der Regel ca. 1 h) vollständig wiederhergestellt ist.

Representative Results

Hier ist ein Modell für eine TVT induziert durch Strömung Verzerrung in der IVC beschrieben. Induktion der Stenose in der IVC initiiert Verzerrung und Stagnation des Blutflusses und nach einer Weile (in diesem Fall, 48 h) führt die Entwicklung einen Thrombus, strukturell ähnlich menschlichen DVT Thromben (Abb. 1A). Das Vorhandensein von einen Thrombus innerhalb der IVC ist optisch leicht zu erkennen (Abbildung 1B). Eine wichtige Ähnlichkeit zwischen Modell und menschlichen DVT ist erhöhter D-Dimer-Plasmaspiegel (Abbildung 2). D-Dimer ist ein Produkt von Fibrin Abbau und seine Präsenz im Blut deutet darauf hin, dass ein aktiver thrombotischer Prozess vor sich geht. Das Modell ist in Abbildung 3-A-CSchritt für Schritt vorgestellt. Die IVC sorgfältig ausgesetzt ist, wird ein Loch zwischen die IVC und der Aorta gemacht und eine Naht (Prolene 7-0) wird durch das Loch unter der IVC gezogen. Dann ist die IVC durch die Naht über einen Abstandhalter (30 G Nadel, Abbildung 3D) ligiert, nachdem die Abstandhalter entfernt ist. Mit diesem Verfahren können etwa 90 % Schließung des IVC lumens verlassen die restliche 10 % patent. Dadurch ist Blut fließen Stagnation führt schließlich zu einer Thrombose. Abbildung 4 zeigt den Hauptnachteil des Modells, Variable Thrombus Größe. Alles, was diese Thromben im gleichen Experiment gewonnen wurden auf Wildtyp männliche Mäuse der gleichen Herkunft, Alter und ähnliche Körpergewicht durchgeführt. Obwohl alle Mäuse Thromben (Thrombose Prävalenz von 100 %) hergestellt, variiert ihre Größe deutlich in einem breiten Spektrum. Abbildung 1: Repräsentative Thrombus nach 48 h Beschränkung/Stenose. (A) einen typischen Thrombus nach 48 h IVC Stenose. Hinweis: rote (Erythrozyten angereichert) und weiß (Thrombozyten angereichertem) Teile. (B) IVC mit (links) und ohne (rechts) einen Thrombus. Skalieren von Balken = 2 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2 : Erhöhte D-Dimer-Plasmaspiegel nach IVC Stenose Anwendung. Mäuse wurden IVC Stenose unterzogen. Blut abgenommen wurde, zu den angegebenen Zeitpunkten wurde, stabilisierte 1:9 mit 3,8 % Natrium-Citrat, Plasma durch Zentrifugation (2.300 x g, 5 min) und D-Dimer Ebenen wurden durch einen ELISA-Kit nach Herstellerangaben bestimmt. Kreise bestimmen Augenwischerei betrieben Mäuse, Kreuze bezeichnen IVC Stenose. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3: Einschränkung/Stenose in der unteren Hohlvene (IVC) Modell der DVT bei Mäusen fließen. Aufeinander folgenden Stufen des Modells werden vorgestellt. (A) ein Loch zwischen die IVC und der Aorta erfolgt und eine Naht ist es um die IVC durchgezogen. (B) eines Knotens wird über ein Distanzstück (30 G-Nadel) geschlossen. (C) der Abstandhalter entfernt: die letzte Ansicht, die der Chirurg sieht vor dem Schließen der Maus. Die gestrichelte gelbe Linie markiert die IVC. LRV steht für linken renal Vene. Skalieren von Balken = 0,2 mm. (D) das Distanzstück (30 G-Nadel). Skalieren von Balken = 2 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4 . Variabilität der Thrombus Größe. Mäuse wurden 48 h IVC Stenose unterzogen. Vorgestellt werden Thromben im gleichen Experiment gewonnen. Skala bars 2 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Hier ist ein Protokoll der IVC-Stenose, die Blut fließen Verzerrung, eine wichtige auslösende Faktor für DVT, imitiert präsentiert. Stenose der IVC induziert die Entwicklung von Thromben in 65-100 % der C57BL/6 Mäusen innerhalb von 48 h und 25-50 % der Mäuse innerhalb von 2-6 h6,8,23 (Brill A, unveröffentlichte Daten, 2016). Eine große Einschränkung der Methode ist die Variabilität der Thrombus Größe24 (Abbildung 4), die nach kurzfristigen (6 h) und langfristige (48 h) IVC Stenose beobachtet wird. Die Gründe für solche Variabilität (angesichts der Tatsache, dass die gleichen Bedingungen, wie z. B. das Distanzstück Anästhesie usw. dienen) bleiben dunkel, aber man kann spekulieren, dass anatomische Unterschiede zwischen den Mäusen (z.B. Breite der IVC, Anzahl und Position der seitlichen und hinteren Zweige) unterliegen diesem Phänomen. Die Variabilität in der Größe des Thrombus macht Thrombose Prävalenz (Prozent von Mäusen mit einen Thrombus) das Hauptergebnis. Thrombose-Prävalenz kann mit Hilfe einer Kontingenztabelle und die Fishers exakter Test verglichen werden. Eines der Experimente war eine Ausnahme, wenn reduzierte Thrombus Größe mit der gleichen Thrombose-Prävalenz nach Injektion von Podoplanin-hemmende Antikörper 7beobachtet wurde.

Diese Methode ist besonders nützlich, wenn venöse Thrombose Einleitung untersucht wird. Es ermöglicht eine frühe Ereignisse in der Gefäßwand, z. B. Einstellung von Zellen, was schließlich zu Thrombose zu untersuchen. Pro oder anti thrombotic Auswirkungen von Drogen können mit Hilfe dieses Modells mit Thrombose Prävalenz wird eine primäre Ausgabe ausgewertet werden. Stenose für 48 h gilt für eine Anti-thrombotische Phänotyp zeigen, während 6 h Stenose kann verwendet werden, wenn ein Prothrombotic Phänotyp erwartet wird. Histologische Analyse der Thrombus und IVC Umfassungsmauer kann auch durchgeführt werden.

Offen bleibt die Frage, ob Seite Zweige sollten ligiert oder links patent. Eine Gruppe hat gezeigt, dass die Unterbindung der Seitenäste vergrößern nicht Thrombus und Standort von einem Seitenast näher als 1,5 mm auf die IVC Ligatur Website dramatisch beeinträchtigt Thrombus Entwicklung25. Schließung der Seitenäste kann induzieren Endothelzellen Verletzungen in ihnen und auch die Zeit der Operation26erhöhen. In unseren Händen verringert Mangel an Seite Zweig Schließung wesentlich Thrombose Prävalenz (bis zu 10-30 % nach 48 h Stenose; Brill, unveröffentlicht) und deshalb verbinden wir alle sichtbare Seitenäste.

Im Idealfall sollten stellt Steuerelemente verwendet werden, wie Mäuse, sogar auf dem gleichen Hintergrund aber aus verschiedenen Quellen etwas anders Thrombose Prävalenz haben können. Wenn die Wirkung des DVT selbst auf alle Parameter (z. B. biochemischen) studiert ist, sollte Schein betrieben Tiere verwendet werden. Sham-betrieben Mäuse unterziehen das gleiche Verfahren aber die Ligatur um die IVC locker geschlossen und ließ dort ohne Stenose zu produzieren.

Die häufigste Fehler (ein kritischer Schritt) in diesem Protokoll ist ein Versuch, der Aorta und der IVC nicht genau in den Winkel zwischen den Schiffen aber etwas niedriger, was in der Regel zu Blutungen führt zu trennen. Wenn eine massive Blutung auftritt, gute Erholung der Maus wird unwahrscheinlich und es wird empfohlen, das Experiment zu stoppen und das Tier einzuschläfern. In der Regel Mäuse gut erholen, bewegen in den Käfig und verlieren Gewicht nicht wesentlich. Wir empfehlen die Verwendung von Mäusen über 20 g für Männer und Frauen und halten Tiere (besonders Männer) in einzelne Käfige nach der Operation bis zum Ende des Experiments zu kämpfen und Verletzungen zu vermeiden. Es wurde in einem anderen (elektrolytische) Modell des DVT berichtet, dass männliche Mäuse größere Thromben als Weibchen27 produzieren. Analyse der Daten ergab nicht wesentlichen Unterschied der Thrombose-Prävalenz zwischen männlichen und weiblichen Mäusen (Brill, unveröffentlicht). Forscher sind daher aufgefordert, Experimente mit dem IVC-Stenose-Modell bei Mäusen beiderlei Geschlechts durchzuführen.

Entwirren von Fäden oder Klammern kann nicht ausgeschlossen werden, insbesondere lange Experimente (eine Woche und länger). So Mäuse sollten mindestens zweimal täglich speziell für Naht Integrität überprüft werden und ein besonderes Augenmerk sollte auf das Aussehen des Blut-Spuren auf dem Käfig-Bett.

Es sei darauf hingewiesen, dass wie jedes andere Tier Modell, Stenose der IVC seine Grenzen in Bezug auf die Übersetzung in den Menschen hat. Zum Beispiel haben murinen IVCs keine Ventile, während menschliche DVT im Inneren Venenklappen entwickelt. Menschen haben auch vertikalen Ausrichtung der Wirbelsäulen mit der Muskelpumpe wird ein wichtiger Mechanismus beschleunigen Durchblutung Venen. Im Gegensatz dazu haben Mäuse horizontalen Wirbelsäulen Ausrichtung keine Rolle des die Muskelpumpe Blut zurück zum Herzen zu unterstützen. Diese Einschränkungen sollten bei Mausdaten mit der menschlichen Krankheit Übersetzung berücksichtigt werden.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der British Heart Foundation (PG/13/60/30406) und der University of Birmingham unterstützt.

Materials

C57BL/6 mice Charles River 8 – 10 weeks old, bothe genders
Scissors WPI 15922
Scissors WPI 14003
Dumont 5/45 forceps FST 11251-35
7-0 Prolene suture Ethicon W8725
6-0 Vicryl suture Ethicon W9981
Cotton buds Spar
Millswabs sterile  Millpledge veterinary  611950
Drapes Kruuse 141765
Glucose Saline-Aqupharm3 Animal Care XVD589
Clear H20 HydroGel 98% sterile water  Clearh2o
Buprenorphine National Veterinary Supplies
Isoflurane vaporizer General Anaesthetic Services
IsoFlo 100% W/W inhalation vapour, liquid National Veterinary Supplies
Sterilizer Steri350 Inotech
Microscope Olympus SZX10 Olympus
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References

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Payne, H., Brill, A. Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis. J. Vis. Exp. (130), e56697, doi:10.3791/56697 (2017).
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