Stenose van de Vena Cava Inferior: een lymfkliertest Model van diep-veneuze trombose
Summary
We beschrijven hier stenose in de vena cava inferior als lymfkliertest model van diep-veneuze trombose. Dit model recapituleert bloed stroom beperking, een van de grote trekkers van veneuze trombose bij de mens.
Abstract
Diepe veneuze trombose (DVT) en zijn verwoestende complicatie, longembolie, zijn van een ernstig gezondheidsprobleem met hoge sterfte. Mechanismen voor de vorming van trombose in aderen blijven onduidelijk. Gebrek aan mobiliteit (b.v.na chirurgie of long-haul vluchten) is één van de belangrijkste factoren die leiden tot DVT. De pathofysiologische gevolg van het gebrek aan mobiliteit is bloed stroom stagnatie in veneuze kleppen. Hier is een model beschreven dat dergelijke verstoring van de stroom als een factor van trombose-rijden nabootst. In dit model, wordt partiële-beperking (stenose) in de vena cava (IVC), inferior gemaakt. Sluiting van ongeveer 90% van de IVC lumen gedurende 48 h resulteert in de ontwikkeling van stolseltjes structureel vergelijkbaar met die bij de mens. De gelijkenissen zijn: i) allermeest naar de volume van trombose is rood, dat wil zeggen, bestaat uit rode bloedcellen en fibrine, ii) de aanwezigheid van een witte gedeelte (lijnen van Zahn), iii) niet-kale endothelial enkelgelaagde, iv) verhoogde plasma D-dimeer niveaus en v) de mogelijkheid om te voorkomen dat trombose door laag moleculair gewicht heparine. Beperkingen omvatten variabele grootte van stolseltjes en het feit dat een bepaald percentage van de wild-type muizen (0 – 35%) kan niet leiden tot een trombose. Naast visuele waarneming en meting, kunnen stolseltjes worden gevisualiseerd door niet-invasieve technologieën, zoals Ultrasonografie, dat voorziet in toezicht op de dynamiek van trombose ontwikkeling. Op kortere tijd punten (1-6 h), intravital microscopie kan worden toegepast om te observeren direct evenementen (bijvoorbeeld, werving van cellen aan de vaatwand) voorafgaand aan de vorming van trombose. Gebruik van deze methode door verschillende teams over de hele wereld heeft het mogelijk gemaakt te ontdekken van de basismechanismen van DVT inleiding en identificeren van potentiële doelen, die misschien wel gunstig zijn voor de preventie.
Introduction
Diep-veneuze trombose (DVT) is de ontwikkeling van stolseltjes in diepe aderen, meestal (maar niet alleen) in de benen. In voegwoorden met longembolie (PE; aangewezen samen als veneuze Thromboembolism, VTE) het ontwikkelt zich in ongeveer 900.000 Amerikanen jaarlijks en vertegenwoordigt een ernstig gezondheidsprobleem en economische probleem1,2. PE, een complicatie van DVT, treedt op wanneer een trombose vrijstaand vanaf de oorspronkelijke locatie krijgt en de longen, die leiden respiratoire insufficiëntie en dood tot kunnen bereikt. Het dodental van VTE overschrijdt sterfte van AIDS, borst kanker en verkeersongevallen, gecombineerde3.
De belangrijkste factor waardoor DVT naast is bekend redenen, zoals kanker of trauma’s, het gebrek aan mobiliteit 4,5. Dit kan voortvloeien uit chirurgie (vooral orthopedische), verlamming, long-haul vluchten of om andere redenen. Bloedstroom in de aders is afhankelijk van de spier pomp en daarom ledemaat immobilisatie resultaten in stagnerende bloed stromen in veneuze kleppen, wat leidt tot trombose. Het doel van de hier beschreven methode is om te recapituleren dergelijke bloed stroom vervorming6,7. Partiële-beperking in de vena cava (IVC), inferior bootst voorwaarden gemaakt in menselijke veneuze kleppen en resulteert in de vorming van een trombose in de structuur vergelijkbaar met menselijke stolseltjes6. Het grote deel van een trombose is rood en bestaat uit rode bloedcellen, fibrine en opneming van de bloedplaatjes. Stolseltjes hebben een kleine “witte deel” verrijkt met bloedplaatjes (Figuur 1), die lijken op “lijnen van Zahn” in menselijke veneuze stolseltjes beschreven. Beide delen van de trombose bevatten ook neutrofielen8, die behoren tot de eerste cellen worden aangeworven op de site van toekomstige trombose6,9. Neutrofielen in het rode gedeelte verdrijven neutrofiele extracellulaire vallen (netten), overwegende dat de neutrofielen in het witte deel lijken te zijn verstoken van netten8. Ook om menselijke DVT, gaat trombose in muizen gepaard met verhoogde plasma D-dimeer niveaus (Figuur 2). Laag moleculair gewicht heparine (Enoxaparine), gebruikt voor DVT profylaxe bij patiënten, voorkomt ook trombose in muizen. Een belangrijk voordeel van deze methode is gebrek aan endothelial denudatie9, karakteristiek van menselijke DVT10. Deze functie maakt IVC stenose een meer klinisch relevante model van DVT dan, bijvoorbeeld, inductie van trombose door ferrichloride, die induceert endothelial denudatie en waarin stolseltjes bestaan voornamelijk uit bloedplaatjes11, 12,,13. Een model van volledige stase in het IVC heeft de voorkeur van de verschillende teams14,15,16. In tegenstelling tot de stenose, waarin residuele stroom onderhouden in het schip worden, toepassing van stase volledig stopt de stroom en dus beperkt de toegankelijkheid van systemisch toegediende stoffen naar de site van de trombose. Ook lijkt het dat de mechanismen die ten grondslag liggen aan de trombose geïnduceerd door stenose en stase verschillend zijn: stenose resulteert in de ontwikkeling van lokale ontsteking (activering van het endotheel, vrijlating van Weibel-Palade lichaamsinhoud, werving van immune cellen en bloedplaatjes aan de vaatwand) veroorzaakt “immunothrombosis”6,9,17, terwijl stase lijkt te veroorzaken eerder trombose gebaseerd, in het bijzonder op weefsel factor en andere stolling en Fibrinolyse-gerelateerde mechanismen18,19,20. Dus, weerspiegelen de stenose en stase modellen lichtjes verschillende aspecten van de ontwikkeling van de veneuze trombose, hoewel hun mechanismen kunnen zeker overlappen. Elektrolytische IVC model (EIM) van DVT21,22 induceert een trombose slechts gedeeltelijk occluding de vaatwand. Daarom is het handig voor het testen van de effecten van systemische toediening van verschillende drugs op trombose groei. Dit model, echter, wordt ervan uitgegaan dat verstoring van de IVC muur integriteit (invoeging van een naald) en inductie van trombose door elektrische stroom maken de pathofysiologische relevantie van dit mechanisme ten minste aanvechtbaar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier, wordt een protocol van de IVC stenose, die bloed stroom vervorming, een belangrijke activerende factor voor DVT bootst, gepresenteerd. Stenose van de IVC induceert ontwikkeling van stolseltjes in 65-100% van C57BL/6 muizen binnen 48 uur en 25-50% van de muizen binnen 2-6-h6,8,23 (Brill A, ongepubliceerde gegevens, 2016). Een belangrijke beperking van de methode is de variabiliteit in trombose grootte24 (Figuur 4), die wordt waargenomen na zowel op korte termijn (6 h) als op lange termijn (48u) IVC stenose. De redenen voor dergelijke variabiliteit (gezien het feit dat dezelfde voorwaarden, zoals de spacer, verdoving enz., worden) blijven obscure, maar men kan speculeren dat anatomische verschillen tussen de muizen (b.v., breedte van het IVC, het aantal en de locatie van zowel kant en terug takken) ten grondslag liggen aan dit verschijnsel. De variabiliteit in trombose grootte maakt trombose prevalentie (procent van muizen met een trombus) het belangrijkste resultaat. Prevalentie van trombose kan worden vergeleken met behulp van een contingentie tabel en the Fisher’s exacte test. Een van de experimenten was een uitzondering toen verminderde trombose grootte met de dezelfde trombose prevalentie na injectie van podoplanin-remmende antilichamen 7werd waargenomen.
Deze methode is vooral handig wanneer veneuze trombose initiatie wordt bestudeerd. Het staat voor het onderzoek naar vroege gebeurtenissen in de vaatwand, zoals werving van cellen, wat uiteindelijk leidt tot trombose. Pro – of anti – thrombotic gevolgen van drugs kunnen worden geëvalueerd met behulp van dit model met trombose prevalentie wordt een primaire uitlezing. Stenose gedurende 48 uur is van toepassing op het onthullen van een anti-trombotische fenotype, dat 6 h stenose kan worden gebruikt als een prothrombotic fenotype wordt verwacht. Histologische analyse van de trombose en omliggende IVC muur kan ook worden uitgevoerd.
De vraag of kant takken moet worden afgebonden of links octrooi blijft open. Één groep heeft aangetoond dat Afbinding van zij takken wordt trombus formaat niet groter en locatie van een zijaansluiting dichter dan 1.5 mm naar de site van de afbinding IVC dramatisch trombose ontwikkeling25 schaadt. Sluiting van zij takken kan induceren endothelial letsel in hen en ook het verhogen van de tijd van operatie26. In onze handen daalt gebrek aan kant tak sluiting aanzienlijk trombose prevalentie (tot 10-30% na 48u stenose; Brill, ongepubliceerd) en dus we alle takken van de zichtbare kant afbinden.
In het ideale geval moeten littermate controles worden gebruikt, zoals muizen, zelfs op de zelfde achtergrond maar uit verschillende bronnen, iets anders trombose prevalentie wellicht. Als het effect van DVT zelf op eventuele parameters (bijvoorbeeld biochemische) is bestudeerd, moeten veinzerij bediende dieren worden gebruikt. Sham bediende muizen ondergaan dezelfde procedure, maar de ligatuur rond het IVC is gesloten losjes en vertrokken er zonder produceren stenose.
De meest voorkomende fout (een kritieke stap) in dit protocol is een poging om te scheiden van de aorta en de IVC niet precies op de hoek tussen de schepen maar iets lager, wat meestal in het bloeden resulteert. Wanneer een massale bloeding optreedt, goed herstel van de muis wordt onwaarschijnlijk en wordt u geadviseerd te stoppen met het experiment en het dier euthanaseren. Normaal, muizen herstel goed verplaatsen in de kooi en doen niet aanzienlijk gewicht te verliezen. Wij adviseren met behulp van muizen boven 20 g voor zowel mannen als vrouwen en houden van dieren (met name mannen) in afzonderlijke kooien na de operatie tot het einde van het experiment vechten en letsel te voorkomen. Men heeft gerapporteerd in een ander (elektrolytisch) model van DVT dat mannelijke muizen grotere stolseltjes dan vrouwtjes27 produceren. Analyse van onze gegevens is niet gebleken aanzienlijke verschil in trombose prevalentie tussen mannelijke en vrouwelijke muizen (Brill, onuitgegeven). Daarom, onderzoekers worden aangemoedigd om het uitvoeren van experimenten met behulp van het IVC stenose model op muizen van beide geslachten.
Ontrafelen van hechtingen of nietjes kan niet worden uitgesloten met name in lange experimenten (per week en langer). Dus muizen moeten worden gecontroleerd ten minste tweemaal per dag speciaal voor hechtdraad integriteit en een bijzondere aandacht moet uitgaan naar het uiterlijk van bloed sporen op de kooi beddengoed.
Opgemerkt moet worden dat, net als ieder ander dierlijk model, stenose van de IVC zijn beperkingen op het gebied van vertaling in mensen heeft. Bijvoorbeeld hebben lymfkliertest IVCs geen kleppen, overwegende dat menselijke DVT binnen veneuze kleppen ontwikkelt. Mensen hebben ook verticale spinale richting met de pomp van de spier wordt een belangrijk mechanisme versnelde bloedstroom in de aders. Muizen hebben daarentegen horizontale spinale oriëntatie met geen rol van de spier pomp in het bloed terug naar het hart te ondersteunen. Deze beperkingen moeten worden overwogen bij het vertalen van gegevens van de muis aan de ziekte bij de mens.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Britse Hartstichting (PG/13/60/30406) en de Universiteit van Birmingham.
Materials
| C57BL/6 mice | Charles River | 8 – 10 weeks old, bothe genders | |
| Scissors | WPI | 15922 | |
| Scissors | WPI | 14003 | |
| Dumont 5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| 7-0 Prolene suture | Ethicon | W8725 | |
| 6-0 Vicryl suture | Ethicon | W9981 | |
| Cotton buds | Spar | ||
| Millswabs sterile | Millpledge veterinary | 611950 | |
| Drapes | Kruuse | 141765 | |
| Glucose Saline-Aqupharm3 | Animal Care | XVD589 | |
| Clear H20 HydroGel 98% sterile water | Clearh2o | ||
| Buprenorphine | National Veterinary Supplies | ||
| Isoflurane vaporizer | General Anaesthetic Services | ||
| IsoFlo 100% W/W inhalation vapour, liquid | National Veterinary Supplies | ||
| Sterilizer Steri350 | Inotech | ||
| Microscope Olympus SZX10 | Olympus |
References
- Heit, J. A. The epidemiology of venous thromboembolism in the community. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (3), 370-372 (2008).
- Huang, W., Goldberg, R. J., Anderson, F. A., Kiefe, C. I., Spencer, F. A. Secular trends in occurrence of acute venous thromboembolism: the Worcester VTE study (1985-2009). Am J Med. 127 (9), 829-839 (2014).
- House of Commons Health Care Committee. The Prevention of Venous Thromboembolism in Hospitalised patients. The House of Commons. , (2005).
- Kuipers, S., et al. Travel and venous thrombosis: a systematic review. J Intern Med. 262 (6), 615-634 (2007).
- Lopez, J. A., Chen, J. Pathophysiology of venous thrombosis. Thromb Res. 123, 30-34 (2009).
- Brill, A., et al. von Willebrand factor-mediated platelet adhesion is critical for deep vein thrombosis in mouse models. Blood. 117 (4), 1400-1407 (2011).
- Payne, H., Ponomaryov, T., Watson, S. P., Brill, A. Mice with a deficiency in CLEC-2 are protected against deep vein thrombosis. Blood. 129 (14), 2013-2020 (2017).
- Brill, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote deep vein thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (1), 136-144 (2012).
- von Bruhl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. J Exp Med. 209 (4), 819-835 (2012).
- Sevitt, S. The structure and growth of valve-pocket thrombi in femoral veins. J Clin Pathol. 27 (7), 517-528 (1974).
- Witsch, T., et al. A novel hollow and perforated flexible wire allows the safe and effective local application of thrombolytic therapy in a mouse model of deep vein thrombosis. J Thromb Thrombolysis. 37 (4), 450-454 (2014).
- Shaya, S. A., et al. Comparison of the effect of dabigatran and dalteparin on thrombus stability in a murine model of venous thromboembolism. J Thromb Haemost. 14 (1), 143-152 (2016).
- Ni, H., et al. Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen. J Clin Invest. 106 (3), 385-392 (2000).
- Wrobleski, S. K., Farris, D. M., Diaz, J. A., Myers, D. D., Wakefield, T. W. Mouse complete stasis model of inferior vena cava thrombosis. J Vis Exp. (52), (2011).
- Diaz, J. A., Farris, D. M., Wrobleski, S. K., Myers, D. D., Wakefield, T. W. Inferior vena cava branch variations in C57BL/6 mice have an impact on thrombus size in an IVC ligation (stasis) model. J Thromb Haemost. 13 (4), 660-664 (2015).
- Siefert, S. A., et al. Enhanced venous thrombus resolution in plasminogen activator inhibitor type-2 deficient mice. J Thromb Haemost. 12 (10), 1706-1716 (2014).
- Schulz, C., Engelmann, B., Massberg, S. Crossroads of coagulation and innate immunity: the case of deep vein thrombosis. J Thromb Haemost. 11, 233-241 (2013).
- Day, S. M., et al. Macrovascular thrombosis is driven by tissue factor derived primarily from the blood vessel wall. Blood. 105 (1), 192-198 (2005).
- Diaz, J. A., et al. Impaired fibrinolytic system in ApoE gene-deleted mice with hyperlipidemia augments deep vein thrombosis. J Vasc Surg. 55 (3), 815-822 (2012).
- Zhou, J., May, L., Liao, P., Gross, P. L., Weitz, J. I. Inferior vena cava ligation rapidly induces tissue factor expression and venous thrombosis in rats. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (6), 863-869 (2009).
- Diaz, J. A., et al. Electrolytic inferior vena cava model (EIM) of venous thrombosis. J Vis Exp. (53), e2737 (2011).
- Diaz, J. A., et al. The electrolytic inferior vena cava model (EIM) to study thrombogenesis and thrombus resolution with continuous blood flow in the mouse. Thromb Haemost. 109 (6), 1158-1169 (2013).
- Brill, A., et al. Extrahepatic high-density lipoprotein receptor SR-BI and apoA-I protect against deep vein thrombosis in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (8), 1841-1847 (2012).
- Diaz, J. A., et al. Critical review of mouse models of venous thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (3), 556-562 (2012).
- Brandt, M., et al. Deep vein thrombus formation induced by flow reduction in mice is determined by venous side branches. Clin Hemorheol Microcirc. 56 (2), 145-152 (2014).
- Geddings, J., et al. Strengths and weaknesses of a new mouse model of thrombosis induced by inferior vena cava stenosis: communication from the SSC of the ISTH. J Thromb Haemost. 12 (4), 571-573 (2014).
- Alvarado, C. M., et al. Male mice have increased thrombotic potential: sex differences in a mouse model of venous thrombosis. Thromb Res. 127 (5), 478-486 (2011).
