Assay простой Cell-based иммунофлюоресценции для выявления аутоантител против рецептора N-метил D-аспартат (NMDA) в крови
Summary
Мы ectopically выразил NR1 Субблок NMDA-рецепторов, отмеченных Зеленый флуоресцирующий белок в человеческих эмбриональных клеток (HEK293) как антиген для выявления аутоантител против NMDA-рецепторов в крови пациентов с подозрением с аутоиммунным энцефалита. Этот простой метод могут быть пригодны для скрининга целей в клинических условиях.
Abstract
Наличие Анти NMDA-рецептора аутоантител может вызвать различные Психоневрологическая симптомы в пострадавших пациентов, называется Анти NMDA рецепторы аутоиммунных энцефалита. Выявление конкретных аутоантител против NMDA-рецепторов в крови и спинномозговой жидкости (CSF) имеет важное значение для точной диагностики данного состояния. NMDA-рецепторов является ионный канал комплекс белков, который содержит четыре подразделения, включая два обязательных NMDA рецепторы Субблок 1 (NR1) и один или два NMDA-рецептора Субблок 2A (NR2A), NMDA рецепторы Субблок 2B (NR2B), NMDA рецепторы субъединица 2C (NR2C), или NMDA-рецептора Субблок 2D (NR2D). Эпитоп Анти NMDA-рецептора аутоантител было сообщено присутствовать на внеклеточные N-концевой домен NR1 субъединицы NMDA-рецептора. Цель этого исследования заключается в разработке простой на основе ячеек иммунофлюоресценции assay, который может использоваться в качестве скрининг-тест для обнаружения аутоантител против NR1 Субблок NMDA-рецепторов в крови для облегчения клинических и базовые исследования Анти NMDA рецепторы аутоиммунных энцефалит.
Introduction
Анти-NMDA рецепторы аутоиммунных энцефалита — недавно признанных болезни сущность, которая может возникнуть у пациентов всех возрастов и влияет на преимущественно женские пациенты1,2. Это один из наиболее часто диагноз энцефалита среди пациентов с первоначальных неизвестной этиологии энцефалита3. Больных, пострадавших с Анти NMDA-рецептора энцефалита обычно имеют продромальный симптомы головной боли или лихорадки, а затем быстрое развитие изменения уровня сознания и множество острых нервно-психических симптомов, включая возбуждение, раздражительность , тревога, бессонница, галлюцинации, бред, агрессии, причудливых поведений, движение аномалии, вегетативной регуляции и захват нападения4,5. Раннее распознавание этого состояния и своевременного лечения с иммунотерапия являются важными для лучший результат и даже полного восстановления в пострадавших пациентов6. Следовательно предполагается, что Анти NMDA рецепторы аутоиммунных энцефалита следует считать важным дифференциальной диагностики пациентов с острой или новое наступление психотического функции7,8.
Помимо клинических особенностей выявление аутоантител против NMDA-рецепторов в крови и спинномозговой жидкости имеет важное значение для точной диагностики Анти NMDA рецепторы аутоиммунных энцефалита9. Большинство из иммунологических тестов для обнаружения Анти NMDA рецепторных аутоантитела доступны в нескольких научно-исследовательских лабораториях10,11, и есть только один assay коммерчески доступных на основе ячеек иммунофлюоресценции для скрининга Анти NMDA-рецептора аутоантител12. Цель этого исследования заключается в разработке простой собственными силами на основе ячеек иммунофлюоресценции assay, который может быть удобно использовать в лаборатории для проверки наличия Анти NMDA рецепторы аутоантител для облегчения клинических исследований Анти NMDA-рецептора аутоиммунная энцефалит. NMDA-рецепторов — это heterotetramer ионный канал комплекс белков конкретно выражена в головном мозге. Он изготовлен из двух обязательных NR1 субблоков и сочетание одной или двух подразделений NR2A, NR2B, NR2C или NR2D13. Предыдущие исследования сообщили, что в внеклеточной N-концевой домен NR1 Субблок5основные epitope мишенью антитела. Следовательно в этом протоколе, мы выражаем человеческий рекомбинантный белок NR1-Субблок NMDA-рецептора, отмеченных Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) в строке эпителиальных клеток человеческого эмбриона почек (HEK293) и разработать на основе ячеек иммунофлюоресценции проба для выявления класса IgG Анти NMDA рецепторы аутоантител в крови.
Protocol
Representative Results
Discussion
Есть несколько на основе ячеек иммунологические анализы на экране наличие аутоантител против NMDA рецепторы, сообщили в литературе, включая живой на основе ячеек иммунофлюоресценции пробирного11, фиксированный на основе ячеек иммунофлюоресценции Пробирная9 , и…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Чжан Гун медицинский фонд (номер гранта CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 и CMRPG3E0633).
Materials
| GRIN1 (GFP-tagged) – Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1 | Origene (Rockville, MD, USA) | RG219368 | NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Rockville, MD, USA) | PS100010 | mammalian vector with C-terminal tGFP tag |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Hilden Germany) | 12362 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher | A-11014 | |
| Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA) | Euroimmun AG, Lübeck, Germany | CA 112d-0101 | |
| Euroimmun Assay Kit |
References
- Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis. Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).
- Lancaster, E. The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis. J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).
- Pruss, H., et al. Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin. Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).
- Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. Autoimmune encephalopathies. Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).
- Chapman, M. R., Vause, H. E. Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment. Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).
- Gable, M., Glaser, C. Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project. Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).
- Dalmau, J., Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Rosenfeld, M. R., Balice-Gordon, R. Clinical experience and laboratory investigations in patients with anti-NMDAR encephalitis. Lancet Neurol. 10 (1), 63-74 (2011).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).
- Irani, S. R., et al. N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes. Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).
- Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay. Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).
- Mayer, M. L. Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes. Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).
- Ramberger, M., et al. Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay. PLoS One. 10 (3), e0122037 (2015).
- Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis. J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).
- Dahm, L., et al. Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease. Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).
- Jézéquel, J., et al. Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project. Biol Psychiatry. , (2017).
