וזמינותו פשוטה מבוססת-תא Immunofluorescence לאיתור נוגדן עצמי כנגד הקולטן N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) בדם
Summary
אנחנו ectopically לידי יחידת משנה NR1 של קולטן NMDA מתויג עם חלבון פלואורסצנטי ירוק בתאים עובריים אנושיים (HEK293) כמו אנטיגן לזהות עצמיים כנגד קולטן NMDA בדם של חולים חשוד עם דלקת אוטואימונית. שיטה פשוטה זו עשויה להיות מתאימים לסינון למטרות בהגדרות קליניים.
Abstract
הנוכחות של נוגדן anti-NMDA הקולטן עצמי יכול לגרום לסימפטומים מנוטלי שונים של חולים מושפעת, כינה דלקת אוטואימונית של קולטן אנטי-NMDA. זיהוי נוגדן עצמי ספציפי נגד קולטן NMDA דם או נוזל מוחי שדרתי (CSF) חיונית לאבחון מדויק של מצב זה. קולטן NMDA הוא יון ערוץ חלבון מורכב המכיל ארבע subunits, כולל שני חובה NMDA קולטן יחידת משנה 1 (NR1), אחד או שניים קולטן NMDA 2A יחידה משנית (NR2A), 2B יחידת משנה של קולטן NMDA (NR2B), יחידת משנה של קולטן NMDA 2C (NR2C), או קולטן NMDA יחידת משנה 2D (NR2D). Epitope של נוגדן anti-NMDA הקולטן עצמי נמסר להיות נוכח בכל תחום N-מסוף חוץ-תאי של יחידת משנה NR1 של קולטן NMDA. מטרתו של מחקר זה היא לפתח וזמינותו פשוטה מבוססת-תא immunofluorescence יכול לשמש כבדיקת סינון כדי לזהות הנוכחות של עצמיים נגד NR1 יחידת משנה של קולטן NMDA בדם כדי להקל על מחקר קליני ובסיסי של דלקת אוטואימונית קולטן אנטי-NMDA.
Introduction
דלקת אוטואימונית של קולטן אנטי-NMDA הינה ישות לאחרונה המחלה יכולה להתרחש אצל חולים בכל הגילאים, והוא משפיע בעיקר המטופלות1,2. . זה אחד אנצפליטיס מאובחנים לעתים קרובות ביותר בקרב מטופלים עם אטיולוגיה לא ידועה הראשונית של דלקת קרום המוח3 החולים מושפעים עם אנטי-NMDA קולטן אנצפליטיס בדרך כלל יש prodromal סימפטומים של כאב או חום, ואחריו התפתחות מהירה של התודעה רמת השינוי ומגוון רחב של סימפטומים מנוטלי חריפה, כולל עצבנות, רגזנות , חרדה, נדודי שינה, הזיות, אשליות, תוקפנות, התנהגויות מוזרות, הפרעות התנועה, dysregulation אוטונומי, ותפיסה תוקף4,5. זיהוי מוקדם של תנאי זה במועד טיפול עם חיסוני חשובים תוצאה טובה יותר, החלמה מלאה אפילו חולים מושפעת6. לפיכך, הוא הציע כי דלקת אוטואימונית של קולטן אנטי-NMDA צריך להיחשב אבחנה מבדלת חשוב מהחולים בדלקת חריפה או התפרצות חדשה תכונות פסיכוטיות7,8.
מלבד תכונות קליני, זיהוי של נוגדן עצמי נגד קולטן NMDA דם או נוזל מוחי-שדרתי חיונית לאבחון מדויק של אנטי-NMDA קולטן דלקת אוטואימונית9. רוב הבדיקות אימונולוגי כדי לזהות את נוגדן עצמי קולטן NMDA נגד זמינים כמה מחקר מעבדות10,11, ויש אחד בלבד זמינים מסחרית מבוססת-תא immunofluorescence assay להקרנה אנטי-NMDA קולטן עצמיים12. מטרתו של מחקר זה היא לפתח וזמינותו פשוטה ללא צורך במיקור חוץ immunofluorescence מבוססת תא בנוחות ניתן במעבדה למסך את הנוכחות של אנטי-NMDA עצמיים קולטן כדי לקדם את המחקר הקליני של קולטן NMDA-נגד דלקת אוטואימונית. קולטן NMDA הוא heterotetramer יון ערוץ חלבון מורכב הביעו במפורש במוח. הוא עשוי שתי subunits NR1 חובה, ואת השילוב של subunits אחד או שניים של NR2A, NR2B, NR2C או NR2D13. מחקר קודם דיווחו כי epitope הראשי ממוקד על ידי הנוגדנים התחום N-מסוף חוץ-תאי של יחידת משנה NR15. לפיכך, ב פרוטוקול זה, אנו מבטאים את החלבון NR1-יחידת משנה רקומביננטי האנושי של קולטן NMDA מתויג עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בשורת תאים אפיתל כליות עובריים אנושיים (HEK293), ולפתח assay מבוססת-תא immunofluorescence כדי לזהות מחלקת IgG של אנטי-NMDA קולטן עצמיים בדם.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם מספר מבוססת תא אימונולוגי מבחני למסך את הנוכחות של עצמיים כנגד קולטן NMDA שדווחו בספרות, כולל חיים מבוססת-תא immunofluorescence assay11, קבוע מבוססת-תא immunofluorescence assay9 , ואת וזמינותו מבוססי cytometry זרימה14. וזמינותו immunofluorescence מבוססת תא חי יש לבצעו מיד לאחר ההכנה של …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי צ’נג קונג רפואי קרן (גרנט מספר CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 ו- CMRPG3E0633).
Materials
| GRIN1 (GFP-tagged) – Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1 | Origene (Rockville, MD, USA) | RG219368 | NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Rockville, MD, USA) | PS100010 | mammalian vector with C-terminal tGFP tag |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Hilden Germany) | 12362 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher | A-11014 | |
| Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA) | Euroimmun AG, Lübeck, Germany | CA 112d-0101 | |
| Euroimmun Assay Kit |
References
- Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis. Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).
- Lancaster, E. The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis. J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).
- Pruss, H., et al. Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin. Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).
- Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. Autoimmune encephalopathies. Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).
- Chapman, M. R., Vause, H. E. Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment. Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).
- Gable, M., Glaser, C. Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project. Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).
- Dalmau, J., Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Rosenfeld, M. R., Balice-Gordon, R. Clinical experience and laboratory investigations in patients with anti-NMDAR encephalitis. Lancet Neurol. 10 (1), 63-74 (2011).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).
- Irani, S. R., et al. N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes. Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).
- Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay. Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).
- Mayer, M. L. Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes. Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).
- Ramberger, M., et al. Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay. PLoS One. 10 (3), e0122037 (2015).
- Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis. J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).
- Dahm, L., et al. Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease. Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).
- Jézéquel, J., et al. Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project. Biol Psychiatry. , (2017).
