Un test Simple Immunofluorescence sur les cellules pour détecter des auto-anticorps contre le récepteur N-méthyl-D-Aspartate (NMDA) dans le sang
Summary
Nous avons exprimé façon ectopique sous-unité NR1 de récepteur NMDA estampillé de la protéine fluorescente verte dans les cellules embryonnaires humaines (HEK293) comme antigène pour détecter des auto-anticorps dirigés contre le récepteur NMDA dans le sang des patients soupçonnés d’être atteinte d’encéphalite auto-immune. Cette méthode simple peut être appropriée pour le dépistage en milieu clinique.
Abstract
La présence d’auto-anticorps récepteur anti-NMDA peut causer divers symptômes neuropsychiatriques chez les patients touchés, appelées encéphalite auto-immune d’anti-NMDA récepteur. Détection de l’auto-anticorps spécifiques contre le récepteur NMDA dans le sang ou le liquide céphalo-rachidien (LCR) est essentielle pour le diagnostic exact de cette condition. Le récepteur NMDA est une protéine de canal ionique complexe qui contient quatre sous-unités, dont deux sous-unité obligatoire du récepteur NMDA 1 (NR1) et un ou deux récepteurs de NMDA sous-unité 2 a (NR2A), 2 b sous-unité de récepteurs NMDA (NR2B), sous-unité de récepteur NMDA 2C (NR2C), ou récepteur NMDA sous-unité 2D (NR2D). L’épitope d’auto-anticorps récepteur anti-NMDA a été signalé à être présents sur le domaine extracellulaire de N-terminale de la sous-unité NR1 du récepteur NMDA. L’objectif de cette étude est de développer un test simple immunofluorescence sur les cellules qui peut être utilisé comme un test de dépistage pour détecter la présence d’autoanticorps dirigés contre une sous-unité NR1 du récepteur NMDA dans le sang pour faciliter la recherche clinique et fondamentale de encéphalite auto-immune du récepteur anti-NMDA.
Introduction
L’encéphalite auto-immune récepteur anti-NMDA est une entité nouvellement reconnue de la maladie qui peut survenir chez des patients de tous âges et affecte principalement les patientes1,2. Il est l’un de l’encéphalite diagnostiqué plus fréquemment chez les patients présentant la première étiologie inconnue d’encéphalite3. Patients atteints d’encéphalite récepteur anti-NMDA habituellement ont des symptômes avant-coureurs d’un mal de tête ou fièvre, suivie par le développement rapide de changement de niveau de conscience et une variété de symptômes neuropsychiatriques aigus, notamment l’agitation, irritabilité , anxiété, insomnie, hallucinations, délire, agressivité, comportements bizarres, des anomalies de mouvement, dérèglement du système nerveux autonome et saisie attaque4,5. La reconnaissance précoce de cette condition et le traitement à l’immunothérapie sont importants pour un meilleur résultat et même pleine reprise de patients affectés de6. Par conséquent, il est suggéré que l’encéphalite auto-immune d’anti-NMDA récepteur soit considérée comme un diagnostic différentiel important de patients qui présentent des caractéristiques psychotiques aigus ou d’apparition récente7,8.
Outre les caractéristiques cliniques, détection d’auto-anticorps contre le récepteur NMDA dans le sang ou le LCR est essentielle pour le diagnostic précis de l’anti-NMDA récepteur encéphalite auto-immune9. La plupart des tests immunologiques pour détecter l’auto-anticorps de récepteurs anti-NMDA sont disponibles dans quelques recherches laboratoires10,11, et il n’y a qu’un seul dosage immunofluorescence de base de cellules disponibles dans le commerce pour le dépistage de la anti-NMDA récepteur autoanticorps12. L’objectif de cette étude est de développer un test par immunofluorescence sur les cellules interne simple qui peut être idéalement utilisé en laboratoire pour dépister la présence d’autoanticorps anti-NMDA récepteur faciliter la recherche clinique du récepteur anti-NMDA encéphalite auto-immune. Le récepteur NMDA est une hétérotétramère ion channel protéine complexe est spécifiquement exprimée dans le cerveau. Il est fait de deux sous-unités de NR1 obligatoires et la combinaison d’un ou deux sous-unités NR2A, NR2B, NR2C ou NR2D13. Une précédente étude rapporte que l’épitope principaux ciblé par les anticorps est au niveau du domaine N-terminal extracellulaire des sous-unités NR15. Par conséquent, dans ce protocole, nous exprimer la protéine recombinante humaine de sous-unité NR1 de récepteur NMDA estampillé de la protéine fluorescente verte (GFP) dans la lignée de cellules épithéliales de rein embryonnaire humain (HEK293) et développer un test d’immunofluorescence sur les cellules pour détecter la classe des IgG des autoanticorps récepteur anti-NMDA dans le sang.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il existe plusieurs tests immunologiques à base de cellules pour dépister la présence d’auto-anticorps dirigés contre le récepteur NMDA rapportées dans la littérature, y compris direct sur les cellules immunofluorescence essai11, fixé le test d’immunofluorescence sur les cellules9 , et axée sur la cytométrie de flux test14. Le test d’immunofluorescence direct de base de cellules doit être effectué peu de temps après la préparation…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation médicale de Chang Gung (numéro de licence CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 et CMRPG3E0633).
Materials
| GRIN1 (GFP-tagged) – Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1 | Origene (Rockville, MD, USA) | RG219368 | NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Rockville, MD, USA) | PS100010 | mammalian vector with C-terminal tGFP tag |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Hilden Germany) | 12362 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher | A-11014 | |
| Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA) | Euroimmun AG, Lübeck, Germany | CA 112d-0101 | |
| Euroimmun Assay Kit |
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