Een eenvoudige cel-gebaseerde immunofluorescentie Assay voor het detecteren van Autoantibody tegen de N-Methyl-D-aspartaat (NMDA)-Receptor in het bloed
Summary
Wij hebben ectopically NR1 subeenheid van NMDA receptor gelabeld met groen fluorescent proteïne in menselijke embryonale cellen (HEK293) als antigeen te detecteren autoantilichamen tegen NMDA receptor in het bloed van patiënten verdacht met auto-immune encefalitis. Deze eenvoudige methode kan geschikt voor screeningonderzoek in klinische instellingen zijn.
Abstract
De aanwezigheid van anti-NMDA receptor autoantibody kan verschillende neuropsychiatrische symptomen veroorzaken in de betrokken patiënten, genoemd anti-NMDA receptor auto-immune encefalitis. Opsporing van de specifieke autoantibody tegen de NMDA-receptor in het bloed of de cerebrospinale vloeistof (CSF) is essentieel voor de accurate diagnose van deze aandoening. De NMDA-receptor is een ion kanaal eiwit complex dat vier subeenheden bevat, waaronder twee verplichte NMDA receptor subeenheid 1 (NR1) en één of twee NMDA receptor subeenheid 2A (NR2A), NMDA receptor subeenheid 2B (NR2B), NMDA receptor subeenheid 2C (NR2C), of NMDA receptor subeenheid 2D (NR2D). De epitoop van anti-NMDA receptor autoantibody werd gemeld om aanwezig te zijn bij het extracellulaire N-terminale domein van de NR1 subeenheid van de NMDA-receptor. Het doel van deze studie is het ontwikkelen van een eenvoudige cel-gebaseerde immunofluorescentie-test die kan worden gebruikt als een screeningtest voor het detecteren van de aanwezigheid van Autoantilichamen tegen NR1 subeenheid van de NMDA-receptor in het bloed te vergemakkelijken van de klinische en fundamentele onderzoek van anti-NMDA receptor auto-immune encefalitis.
Introduction
Anti-NMDA receptor auto-immune encefalitis is een nieuw herkende ziekte-entiteit die kan optreden bij patiënten van alle leeftijden, en beïnvloedt overwegend vrouwelijke patiënten1,2. Het is een van de meest frequent gediagnosticeerde encefalopathie bij patiënten met eerste onbekende etiologie van encefalitis3. Patiënten getroffen met anti-NMDA receptor encefalitis meestal hebben prodromal symptomen van een hoofdpijn of koorts, gevolgd door de snelle ontwikkeling van de wijzigingen in bewustzijn en een verscheidenheid aan acute neuropsychiatrische symptomen, met inbegrip van agitatie, prikkelbaarheid , angst, slapeloosheid, hallucinaties, wanen, agressie, bizar gedrag, afwijkingen van de beweging, autonome disregulatie en inbeslagneming aanvallen4,5. Vroege erkenning van deze aandoening en tijdige behandeling met immunotherapie zijn belangrijk voor een beter resultaat en zelfs volledig herstel in getroffen patiënten6. Vandaar, wordt voorgesteld dat de anti-NMDA receptor auto-immune encefalitis moet worden beschouwd als een belangrijke differentiële diagnose van patiënten met acute of nieuwe-onset psychotische kenmerken7,8te presenteren.
Naast klinische eigenschappen is detectie van autoantibody tegen de NMDA-receptor in het bloed of LIQUOR essentieel voor de accurate diagnose van anti-NMDA receptor auto-immune encefalitis9. De meeste van de immunologische tests voor de opsporing van de anti-NMDA receptor autoantibody zijn beschikbaar in een paar onderzoek laboratoria-10,11, en er is slechts één verkrijgbare cel-gebaseerde immunofluorescentie assay voor screening de anti-NMDA receptor autoantilichamen12. Het doel van deze studie is het ontwikkelen van een eenvoudige in-house cel-gebaseerde immunofluorescentie-bepaling die op het scherm van de aanwezigheid van anti-NMDA receptor autoantilichamen ter vergemakkelijking van het klinische onderzoek van anti-NMDA receptor gunstig in het laboratorium kan worden gebruikt auto-immune encefalitis. De NMDA-receptor is een heterotetramer ion kanaal eiwit complex specifiek uitgedrukt in de hersenen. Het bestaat uit twee verplichte NR1 subeenheden, en de combinatie van een of twee subeenheden van NR2A, NR2B, NR2C of NR2D13. Een eerdere studie gemeld dat de belangrijkste epitoop door de antilichamen gericht op het extracellulaire N-terminale domein van de NR1 subeenheid5 was. Vandaar, in dit protocol, we uiten het menselijke recombinante eiwitten van de NR1-subunit van NMDA receptor gelabeld met groen fluorescente proteïne (GFP) in de menselijke embryonale nier epitheliale cellijn (HEK293), en ontwikkelen van een cel-gebaseerde immunofluorescentie assay te detecteren de IgG-klasse van anti-NMDA receptor autoantilichamen in het bloed.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn verschillende cel-gebaseerde immunologische tests op het scherm van de aanwezigheid van Autoantilichamen tegen NMDA receptor gemeld in de literatuur, met inbegrip van de levende cel-gebaseerde immunofluorescentie assay11, vaste cel-gebaseerde immunofluorescentie assay9 , en stroom cytometry gebaseerde assay14. De levende cel-gebaseerde immunofluorescentie bepaling moet kort na de voorbereiding van cellen die zijn ectopically uiting geven aan …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Chang Gung Medical Foundation (subsidie nummer CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 en CMRPG3E0633).
Materials
| GRIN1 (GFP-tagged) – Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1 | Origene (Rockville, MD, USA) | RG219368 | NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Rockville, MD, USA) | PS100010 | mammalian vector with C-terminal tGFP tag |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Hilden Germany) | 12362 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher | A-11014 | |
| Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA) | Euroimmun AG, Lübeck, Germany | CA 112d-0101 | |
| Euroimmun Assay Kit |
References
- Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis. Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).
- Lancaster, E. The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis. J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).
- Pruss, H., et al. Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin. Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).
- Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. Autoimmune encephalopathies. Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).
- Chapman, M. R., Vause, H. E. Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment. Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).
- Gable, M., Glaser, C. Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project. Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).
- Dalmau, J., Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Rosenfeld, M. R., Balice-Gordon, R. Clinical experience and laboratory investigations in patients with anti-NMDAR encephalitis. Lancet Neurol. 10 (1), 63-74 (2011).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).
- Irani, S. R., et al. N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes. Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).
- Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay. Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).
- Mayer, M. L. Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes. Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).
- Ramberger, M., et al. Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay. PLoS One. 10 (3), e0122037 (2015).
- Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis. J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).
- Dahm, L., et al. Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease. Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).
- Jézéquel, J., et al. Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project. Biol Psychiatry. , (2017).
