Laboratuvarda ölçmek yüzeyler bitki bakterilerin bağlılık

1. Axenic bitki materyali hazırlanması Suda yetiştirilen Fideler hazırlayın. Tohum (az 30) az sayıda bir 30, 50, 100 veya 150 mL Cam kabı yerleştirin. Bu iletişim kuralı ile domates, yonca, Arabidopsis thaliana, bezelye, bakla, tütün, marul ve havuç tohumu kullandık.Not: kaç tohum birlikte bir tohum diğerine yayılan kirlenme olmadan sterilize belirlemek için adım 1.1.2 bakın. Tohum % 80 etanol ile kapak ve kısaca girdap. 1 dk. için emmek tohum izin. Etanol dökün ve bir çözüm cilt ticari çamaşır suyu (NaClO) % 50 ve % 0.1 ile tohum kapak Triton X-100 musluk suyundaki. 20 dk için emmek tohum izin.Not: tohum fasulye tohumu gibi büyük iseniz, tamamen tohum yüzeydeki mantarlar öldürmek için iliklerine zaman uzatmak gerekli olabilir. Çamaşır suyu karışımı dökün ve tohumlar 3 kez steril su ile yıkayın. Her yıkama için 1 dk suda ıslatın tohum izin. Elde etmek için axenic fidan tohum büyüklüğüne bağlı olarak 5 ile 25 mL arasında steril su az miktarda ekleyin. Tohum ve su içine tohum çimlenme için steril Petri kabına dökün.Not: Su çanak alt kapak ama kök tüyleri oluşumu teşvik için tohum kapsamaz. Sadece tek bir tür organizmanın mevcut Axenic hangi bir kültür açıklar. Fidan 1 cm ve 10 cm (yaklaşık 4 gün domates ve A. thaliana ve 1 ila 3 gün süreyle yonca) arasında istediğiniz boyuta ulaşana kadar karanlıkta kuluçkaya. İçin daha büyük tohum folyo ile kaplı bir cam tabak gibi daha–dan 100 mL kapasiteli bir kapalı steril kap kullanın. Belirli tohum çok yüzey-Sterilizasyon sonra uygulanabilir veya tohum içinde kalması mikroorganizmalar ile kirlenme sıklığını belirler.Not: zaman zaman tohum mikroorganizmaların yüzey-sterilizasyon tarafından öldürülemez tohum kat altında taşıdığı bu gereklidir. Kirli tohumlar sıklığı bir tohum yerinde grup tohum ile bakteri ve mantar tedavisi hayatta bir tohum nedeniyle kontamine olma riski yüksek bir anda sterilize etmek için kaç tohum belirlemek için kullanın. Adımları 1.1.1 1.1.3 aracılığıyla yerine getirir. Tohumlar bir besin agar Petri kabına yerleştirin. Koymak böylece bunların tek tek attı onları aralığı 10-30 tohum her yemek. Bulaşıkları teyp veya sızdırmazlık film ile kapatın. Her gün görünür mikroorganizmaların tohumlarından akıbet için Puanlama 25 ° C’de 3-5 gün kuluçkaya. Kuma yetiştirilen Fideler hazırlayın. Fidan kum kullan bakteriyel yapışma deneylerde için yetiştirilen olabilir. Adımları 1.1.1 1.1.3 aracılığıyla yerine getirir. Otoklav kuvars veya deniz kum sterilize. Bunların her ikisi de bazı organik materyal içeren. Eğer bu deneme etkiler, onu iki kez hacmi 10 dk. izin ver için 0,1 M HCl. karışımı ile yerleşmek ve sıvı dökmek kaplayan kum kum yıkayın. Kum su ile 3 kez ve bir kez ile etanol 0.1 M gelince aynı iletişim kuralını kullanarak iki ek su durular HCl. Sterilize otoklav yıkanmış kum ardından durulayın. Kapsayıcılar içinde % 50 çamaşır suyu 5 min için onları batış tarafından sterilize ve batma tarafından steril su ile 5 kere yıka. Kuru ve alt film mühürleme ile mühür etmelerine izin. Filmin üreticisinden elde gibi genellikle iç mikroorganizmaların ücretsizdir konteyner içine dönük yerleştirilmelidir tarafı. Steril kum yeterince steril su ile yeterince ıslak kum sopa karıştırın. Tutar ne kadar kuru kum olduğuna bağlı olacaktır. Genellikle kum hacminin 10- yeterlidir. Islak kum kökleri uzunluğu için yeterli derinlik üstüne kum sürgün büyümesi için gerekli ve yeterli boşluk sağlayan kapsayıcı yerleştirin. Tam mesafeler türler ve kullanılan bitki çeşitli bağlıdır. Bitki tohumları. Kum kum (yaklaşık 1-5 mm) aşağıda tohum yerleştirmek için yeterince derin bir steril cam çubuk ile sığ bir delik açın. Tohum deliğe yerleştirin. Kum ince bir tabaka ile bin yeter. Üst kapsayıcı film giriş ek mikroplar ve su kaybı önlemek için mühürleme ile kapatın. Laboratuarda bir ışık altında veya sera bir uygun sıcaklık ve gün-uzunluk türler ve çeşitli bitki için bitkiler büyümek. Domates, yonca veya Arabidopsis thaliana oda sıcaklığında ve 12 h açık/koyu döngüleri kullanın. Fidan kum (1-2 mm çap ve kök kumla kaplı derin yeterli olarak) bir delik bitki. Steril cam çubuk ile delik açın. Kök dikkatle gerekli ve kumla kenarlarına delik doldurmak bir steril paslanmaz çelik tığ kullanarak delik deliklere. Alternatif olarak, bitkiler axenically ya da MS tuzlar gibi tuzları karışımı içeren agar büyümek. Sürgünler doğrudan agar içinde yetiştirilen axenic bitkilerin kullanın. Kökleri ile agar agar bitki yüzey ve bakteri için sopa olarak büyüdü kaçının. Bu bitki yüzeye bakteriyel yapışma yanlış bir izlenim neden olabilir. 2. diğer bitki materyali hazırlanması Sera yerli mikrop sayısını azaltmak için kullanmadan önce su ile yetiştirilen bitki materyali yıkayın. Bakteri ve mantar bitkiler üzerinde olacak. Tek hücreli toprakta, kökleri ve olasılıkla yaprakları mevcut olacaktır. Çamaşır suyu veya etanol ile yıkama tesisi yüzeyi tümüyle değiştirecek ve tavsiye edilmez. Eğer mikroplar önemli sayıda kalır, seyreltilmiş sıvı el sabunu bitkilerle tedavi veya hidrojen peroksit (% 0.01) kaldırmak veya mikropları öldürmek için seyreltik su yıkama sonrası. Bu genel olarak daha az çamaşır suyu veya etanol daha bitki için zarar. Yerel bir pazarda satın bitki materyali dezenfekte etmek zor olduğu için tabi uzun depolama olmuştur görünmüyor malzeme seçin. Malzemenin, kahverengi veya hasarlı parçalar kaçının. Su ile yıkayın ve kesme sitelerinde birikmiş var test bakteriler bakteri (ve ökaryotlar) ile etkileşimleri ilgi değilseniz hangi daha önce kullanmadan önce kesilmiş malzeme biter taze kesim yapmak. Bitki yüzey değiştirecek gibi çamaşır suyu veya etanol ile yıkayın değil. Yara siteleri tedavi. Yara siteleri genellikle bakteri bitki malzeme18iç erişim sağlar. Engellemek veya bakteriyel eki ve yara veya erimiş parafin kesme kenar daldırma veya küçük bir fırçayla erimiş parafin ile site resim malzeme hazırlanmasında oluşturulan kesim siteleri aracılığıyla hareketi azaltmak. Bu doku zarar verebilir bir spatula veya herhangi bir keskin alet kullanmayın. Mühür meyve parafin ile domates gibi izleri kaynaklanıyor. Bazı bakteriler parafin altına alan içine yüzmek, ama sayıları genellikle küçük. Yara siteleri içine bakteriyel giriş ilgi, bakteri taşıyabilirsiniz mesafe su akışları veya difüzyon tarafından taşınan çözümü eklendi bir boya hareket gözlemleyerek tahmini ise. Yeşil flüoresan protein (GFP) gibi floresan bir protein onları kodlama bir gen tanıtarak hareketli bakteri işaretlemek ve onları iz floresans mikroskobu adım 6.1.219′ açıklanan kullanarak. 3. bakteri hazırlanması Bakteri büyümek. Kullanım koşulları bakteri en yakın yaklasik bir orta hemen laboratuvar dışında gerçek dünyadaki bitki Karşılaşma öncesinde maruz kalmış olamaz muhtemeldir. Karbon ve azot kaynakları iyonları, varlığı yanı sıra özellikle divalent katyonlar (Ca, Mg, Fe, Mn ve Zn) ve fosfat ve ortamın pH önemlidir. A. tumefaciens ve diğer toprak bakteriler20için en az AB Orta veya Luria suyu kullanın. Hangi gut kaynaklı, E. coliiçin Luria suyu kullanın. İndükleyicileri kök exudates gibi veya soytone gibi ticari bitki özleri veya şeker sükroz veya ksiloz gibi orta21′ e ekleyin. Bu maddelerin indükleyicileri kullanılması halinde, örneğin %0,01 düşük konsantrasyon ekleyin. Onlar kullanılan karbon kaynakları varsa, daha yüksek bir konsantrasyon, örneğin %0,1 ekleyin. Bakteriyel inoculum hazırlayın. Bakteri steril su veya orta kuluçka yapılacaktır ve bitki materyali ekleyin sulandırmak. Uygun seyreltme 4.2 ve 4.3 adımlarda anlatılan. Büyüme medya bakteri kullanmadan önce kaldırmak için 10.000 x g 2 min için de bakteriyel süspansiyon santrifüj kapasitesi, süpernatant dökün ve bakteri vortexing tarafından resuspend bitki materyali ile kuluçka için kullanılan aynı ortamda onları. Bu yöntem kaldırmak veya sayı veya hücre dışı malzeme ve exopolysaccharides, kapsül, flagellae ve/veya pili gibi ekleri miktarını azaltabilirsiniz. Bu yüzey yapıların korunacak önemli ise, sonra sadece onları aşı önce bakteri sulandırmak veya 3.2.2. adımda açıklanan alternatif yöntemi kullanın. Büyüme orta kaldırmak için alternatif bir yöntem bakteri nitroselüloz veya polikarbonat filtrenin gözenek boyutu 0.2 µm veya daha az olan üzerinde toplamak. Kuluçka orta bakterilerle yıkama ve onlara nazik sallayarak veya filtre Orta steril bir kap içinde vortexing tarafından resuspend. 4. aşı bakteri Bakteriyel yapışma belirlemek için kullanılacak ölçü referans ile aşılanmış bakteri sayısını ve kuluçka süresini belirler. Mikroskobik araştırmalar az 1 gün kez kuluçka içeren nispeten çok sayıda bakteri aşılamak. Son bir bakteri konsantrasyonu mL başına 10’dan fazla6 bakterilerin ulaşmak için kültür bir miktarda ekleyin. Uzun kuluçka süreleri için bakteriyel inoculum boyutunu küçültür. Hangi bakteri yapışma uygun hücre sayımları tarafından ölçülen çalışmalar eklemek için kültür 10 son bir bakteriyel konsantrasyon ulaşmak için bir miktar3 mL başına 106 bakteri için. O kadar çok bakteri metabolizmalarını kuluçka orta pH veya oksijen konsantrasyonu değişir eklemekten kaçının. PH pH kağıt veya bir elektrot kullanarak ölçmek. Oksijen konsantrasyonu bir oksijen elektrot kullanarak ölçmek. Kuma yetiştirilen bitkiler için üç farklı şekilde aşılamak. Bakteri ile tohum 1 dk. için tohum bir süspansiyon mL başına yaklaşık 106 bakterilerin suda ıslatarak ekimden önce aşılamak. Kök axenic fidan fide kök 1 cm uzunluğunda daldırma veya bir süspansiyon mL su 1 dakika başına 106 bakterilerin tüm fide yerleştirerek bölümünde 1 ve açıklandığı gibi takımıdır tarafından aşılamak. Kum mL başına yaklaşık 103 bakterilerin son bir konsantrasyon vermek ekimden önce kum ile bakteri karıştırma veya fide mL başına 106 bakterilerin bir süspansiyon ile Ekimden sonra sulama aşılamak. 5. bitki materyali ile bakterilerin kuluçka Bitki materyali steril su veya sukroz ve mineral tuzları ile bakteri sıvı ortamda kuluçka için kuluçkaya veya bitki doku kültürü Orta (1:10 gibi MS tuzları seyreltme)22,23. Hangi bakteri değil uygun bir kap kullanın. Bitki yüzey bulundurmaya çalışın batma veya yumuşak ajitasyon sürekli kapalı. Dinç ajitasyon yapışma önlemek veya hatta bitki yüzeyinden bakteri kaldırın. Işık mikroskobu bitki materyali inkübasyon durdurmak ve ölçümler yapmak ne zaman belirlemek için zaman aralıkları değişen sonra gözlemlemek. Bir zaman yapıştırılması kez her 1-4 h veya etkileşim hızına bağlı olarak her gün alınan örnekler ile değerli derstir. Kuma kuluçkaya için adım 5.1 sıvı ortamda kuluçka için açıklanan aynı önemli noktalar geçerlidir. 6. ölçüm mikroskobu kullanılarak yapıştırılması Kolay görüntüleme için Nomarski veya faz kontrast optik ile yüzeylerde Bakterilerin mikroskobik ölçümleri yapmak. Ancak, herhangi bir alan parlak mikroskop 20 X veya daha yüksek büyütme ile kullanılabilir. Mikroskobik gözlem bakteri rastgele dağıtılmış veya belirli sitelerde yer alan Eğer belirlemek için kullanın. Ayrıca onlar singly veya kümeleri bağlı olup olmadığını kontrol edin. Bakteriyel büyüme veya tuzak yapışma sonra düşündüren microcolonies varlığı için bak. Bakteri bir biyofilm yüzeyde form görünmektedir kontrol edin.Not: Bir biyofilm bakteri yüzeye bağlı ve bir hücre dışı matriks23,24,25tarafından çevrili büyük bir sayıdır. Yapısı pürüzsüz ve düzgün veya daha karmaşık bir mimariye sahip. Bitki yüzeyler ile ilişkili biyofilmler eğitim yöntemleri tarif17olmuştur. Bakteri floresan bir marker ile öğesini kullanın. Diğer bakteriler mevcut ve faiz bakteri gibi yeşil flüoresan protein flüoresan bir etiket tarafından tanımlanır, floresans mikroskobu diğer bakteri26kümelerdeki etiketli bakteri varlığı belirlemek için kullanın. GFP için bir filtre 490 nm uyarma ve 520 nm emisyon ile kullanın. Floresan etiketi olumsuz bakteri axenic vahşi türü bakteri ve Nomarski ve floresan optik kullanarak aynı baskı etiketli bakteri eşit bir karışımı malzemeden bağlılığı gözlemleyerek etkileyen değil kontrol edin. Floresan ve karanlık bakteri rasgele karışık ve eşit sayıda mevcut ise etiketi ile tahlil karışmaması. Ekli bakteri sayısını belirleyin.Not: Mikroskop ekli bakteri sayısını belirlemek çok zordur. Bağlama düzensiz bitki yüzeylere olduğunda genellikle nicel ölçüm almak mümkün değildir. Elektron mikroskobu (Bu makalede açıklanan değil) tarama böyle ölçümleri yapmak için kullanılabilir. Bakteri kök saç gibi pürüzsüz bir yüzey bağlı zaman kök saç mm kök saç uzunluğu başına kenarına bağlı bakteri sayısını saymak. Kök tüyleri kabaca aynı boyutta ve ölçümleri karşılaştırarak şekil kullanmak için dikkat ediniz. Mikroskop nesneleri boyutunu belirlemek için bu üzerinde ölçülen işaretler ile ticari bir slayt kullanın. Gözlemlemek ve bu slayt olarak deneysel malzeme için kullanılan aynı değerlerinde fotoğraf ve elde edilen görüntüleri photomicrographs nesneleri boyutunu belirlemek için kullanın. Örnek için mikroskobu hazırlayın. Örnek yıkayın. Örnek bir damla su veya kuluçka orta için mikroskop slayt üzerinde taşımak ve doğrudan gözlemlemek.Not: Bu olsaydı hiçbir bakteriyel büyüme veya gerçek bakteriyel ölüm orada olduğunu birçok ücretsiz bakteri olması olası avantajı vardır. Ücretsiz bakteri yokluğu olabilir ki bakteriyel ölüm ya da bakteriyel bağlama içinde kuluçka gerçekleştirildiği kapsayıcısına bir uyarı işareti olarak almak. Örnek yıkama etkisini Şekil 1′ de gösterilen. Örnek nazikçe yıkayın su veya kuluçka ortamda sıvı bir şişede yerleştirerek ve flakon yavaşça ters çevirme. Sonra örnek gözlem için taze sıvı içinde mikroskop slaytta yer. Bir sıradan kapak astarlı ve mikroskop slayt kullanarak sıvı örneğinde bağlayın. Örnek kalın ise ve kapak notu altında bir çıkıntı yapar, press-apply kapak notu kullanın. Bu kapak paket fişi kauçuk veya plastik kapak notu kenarındaki bir yüzüğüm var. Sıvı ve örnek kapak notu kuyuda yerleştirin ve sonra slayt üstüne yerleştirin ve slayt kapak dekonta imzalamaya hafifçe bastırın. Ters çevir ve inceleyin. Alternatif olarak slayt ve kapak kayma benzer bir şekilde sayma bir yosun kullanın. Not Slaytları bu derinliği genellikle 20 X büyütme daha büyük bir objektif lens ile muayene edemem. Resim 1 : Hazırlanmasında bağlı bakteri sayısını belirlemek için bir örnek adım. A. tumefaciens bağlama domates kök tüyleri (A, B ve C) ve naylon konu (D, E ve F). Su olmadan hem yıkama bakteri (siyah oklar) bağlı ve ücretsiz bakteri (beyaz ok) görülebilir monte örnekleri (A ve D). Yıkandıktan sonra ilişkili bakteriler kalır, ancak ücretsiz bakteri yok daha uzun mevcut (B ve E) vardır. Sonra sonication ilişkili bakteriler örnek yüzey (C ve F) kaldırılmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Floresan bakteri kullandıysanız, kum kaldırıldıktan sonra mikroskop örnekte inceleyin. Kum parçacıkları bakteri gözlem ile müdahale gibi kuma yetiştirilen bitkilerin kökleri genellikle Mikroskopi için uygun değildir. Bitki büyüme konteyner adım 7 göre kaldırın. Kökleri su bir kapsayıcısına getirin ve karışımı yavaşça kabın altına razı olacak kum çıkarmak için. Bitki yıkama sudan çıkarın ve örnekte olduğu gibi adım 6.3.3 mount. 7. ölçüm kullanarak geçerli hücre adezyon sayar Bir sonicator kullanarak kalıcı ekli bakteri sayısını belirleyin. İlişkisiz bakteri kaldırın. Örnek arabellek veya kuluçka orta bitki materyali kapsar ve birkaç kez şişeyi ters yıkama yeterli su ile bir şişe yerleştirin. 10’dan fazla3 ücretsiz bakteri mL başlangıç kuluçka mevcut başına olsaydı, bunların tümünü kaldırmak için sıralı yıkama gerçekleştirin. Bir ışık mikroskobu kontrol edin (bkz. Adım 6.3) ücretsiz bakteri olup olmadığını belirlemek için. Ücretsiz bakteri sayısı önemli bir azalma olana yıkayın ama ücretsiz bakteri sayısı hiç sıfıra azaltmak bu yüzden ilişkili ve ilişkisiz bakteriler arasında bir denge olduğunu unutmayın. Örnek bir forseps veya spatula ile sıvı yıkama şişe kaldırın. İncubations sıvı bitkilerin ilişkili bakteri sayısını belirleyin. Bir şişe içinde yıkanmış örnek askıya alma ve ölçülü miktarda su, kuluçka orta veya çamaşır arabellek ile kaplayın. Yeterli sıvı örnek kapsayacak şekilde kullanın. Bir banyo sonicator şişe yerleştirin ve bir dakika için solüsyon içeren temizleyicide. Örnek kaldırmak ve ilişkili bakteriler bitki kaldırılması olup olmadığını belirlemek için ışık mikroskop altında incelemek. Bir örnek tarafından sonication bakterilerden kaldırılması Şekil 1′ de gösterilen. Yoksa hala ilişkili bakteriler mevcut örnek gibi ilişkili hiçbir bakteri örnek yüzeyinde kalır bir saat kadar sonicating devam edin. İlişkili bakteriler sonication tarafından kaldırılamazsa, 1-10 mg/mL steril Kuvars kum ekleyin ve sonication ve mikroskobik inceleme yineleyin. Adım 7.1.3.2 en etkili görünen sonication yordamı bakteri canlılığı sonication için kullanılmak üzere çözüm sıvı kültüründe bakterilerden askıya tarafından azaltmaz olduğunu belirlemek (gerekli Kuvars kum, ekleyin). Geçerli hücre sayısını belirler. Bakteri solüsyon içeren temizleyicide ve uygun hücre sayısı yeniden belirlemek.Not: geçerli hücre sayısında bir azalma ise, yordam tedavi uygulanabilir hücre sayısı üzerinde hiçbir etkisi kadar sıvı ve/veya sonication zaman kompozisyon değiştirerek değişiklik. Geçerli hücre sayımları için kullanılan seyreltme arabellek geçerli hücre sayısı farklı seyreltme arabellekleri ve/veya su kullanılarak yapılan karşılaştırma tarafından kullanılan koşullar altında inkübe bakteriler canlılığı etkilemez belirlemek. Homojenizasyon kullanarak kalıcı ekli bakteri sayısını belirleyin. Örnek steril bir harç veya blender veya diğer homojenizasyon aygıt ekleyin. Steril su, kuluçka orta veya arabellek27yıkama ölçülen hacmi ile bin yeter. Örnek karşılamak için yeterli bir birim kullanacak. Bir blender için 100 mL kullanın. Örnek de homojenize oluncaya kadar eziyet. Bitki dokudan yayımlanan homojenizasyon emin olmak için bu asit pH 7 aşağıda içinde keskin bir düşüş neden olmayacağından sonra pH kontrol edin. PH düşmüştür bir arabellek fosfat tampon gibi homojenizasyon sıvı pH korumak için kullanın. Geçerli hücre sayısını belirler. Bakterilerin antibiyotik direnci ile işaretlenmiş kullanın. Bakteri birden fazla türü mevcut olduğu durumlarda, bakteri suşlarının antibiyotik (genellikle rifampisin ve nalidixic asit) spontan direnç kullanarak işaretleyin. Antibiyotik kullanmak için düzeyini belirleyin. Kuluçka içinde bulunması beklenen diğer organizmalar kültürleri yoksa, antibiyotik yetiştirilen bitkiler seçilmiş konsantrasyonları bir aralığını içeren plakaları ile amaçlanan kuluçka koşulları altında bu kültürler plaka. Herhangi bir bu organizmaların büyümesini izin vermeyen en düşük konsantrasyonu belirlemek. Bu en düşük konsantrasyon antibiyotik için test bakteri dayanıklı olması gerekecektir. Spontan antibiyotik dirençli mutantların edinin. Bakteri kültürü zengin Orta için geç günlüğü veya durağan faz büyümek. Plaka 0.1 mL uygun bir konsantrasyon, istenen antibiyotik içeren bir plaka üzerine su katılmamış. 7.3.1.1 adımda anlatıldığı gibi kullanmak için konsantrasyonları belirlemek. Devam et ve büyümek ve böylece için antibiyotik dirençli bakteri arındırmak. Antibiyotik direnci bakterilerin büyümesini bir büyüme eğrisi üst ve antibiyotik dirençli suşların sıvı ortamda yaparak azaltmaz olduğunu belirlemek. Eğer bu mümkün antibiyotik dirençli bakteri axenic bitki materyali kolonizasyon üst soy olarak aynı düzeyde görüneceğini belirlemeye. Kuma yetiştirilen bitkiler bağlı canlı bakteri sayısını belirleyin. Bitki konteyner ve kum çıkarın. Bitkilerin kaplarından kaldırmak için önce üst ve alt kapsayıcı üzerinde sızdırmazlık malzemeleri temizleyin. Kap bir steril kağıt parçası yerleştirin ve yavaşça yavaşça konteyner malzeme gevşetmek için bir yüzeye karşı eleştiri tarafından bir büyük konik silindir tüm kum veya toprak ve bitki çıkarın. Gerekirse, bir spatula veya çubuk malzeme konteyner alttan giriyor kenarlarda gevşetmek için kullanın. Kum veya bitki içeren toprak silindir kağıt üzerinde özgür olduğunda, bitki kök ortaya çıkarmak için ortadan bölünmüş. İsterseniz, örnek kapsayıcı kenarı yakınındaki yanı sıra kök yakınındaki gelen kum taneleri almam. Bu yayılmış (ve birikimi ve büyüme) bakteri belirlemek yararlı olabilir. Kök uzunluğu ölçmek. Kök almak ve çıkarmak belgili tanımlık kum ve gevşek kök (rizosferde malzeme) ölçülen miktarda su veya arabellek kökte daldırma ve hafifçe sallayarak kalarak bakteri. Luria agar gibi uygun bir ortam üzerine kaplama tarafından elde edilen süspansiyon yer alan bakteriler uygun hücre sayısını belirler. Bu gevşek kökle ilişkili bakteri sayısını temsil eder. Sonication tarafından sıkı bir şekilde bağlı bakteri kaldırın ve 7.1 adımda anlatıldığı gibi sayıları belirler. Alternatif olarak, belirlemek için sıkı bir şekilde bağlı bakteri kök konumunu yerleştirin yıkanmış kök besin agar veya uygun ortamı içeren bir petri yüzeyinde. Bakteri kolonileri kök konumunu önümüzdeki 3 gün bir diseksiyon mikroskop veya büyüteç kullanarak gözlemlemek. Bitki başına, cm2 yüzey alanının başına, cm kök uzunluğu veya başına gram taze ağırlık doku bakteri sayısı olarak sonuçları hızlı. Birden çok çoğaltır aynı gün ve aynı zamanda farklı günlerde farklı bakteri kültürleri ve farklı çok sayıda bitki materyali kullanarak çoğaltır. 8. bir yapışma etkisi kuluçka koşulları nedeniyle bakteri veya bitki yanıt olup olmadığını belirleme Ölü ya da maktul bitki malzeme kullanın. Onu öldürmek için bitki kimyasalları, fiksajlar veya ısı gibi diğer tedaviler çeşitli malzeme tabi. Bitki materyali su ve kuluçka ortamda herhangi bir bu tedaviler kullanımdan sonra iyice yıkayın. Sonra bakteri aşılamak. Bu bitki yüzeyi yok değil ama böylece bakteriler için yanıt veremiyor metabolik olarak etkin olmayan yapacaktır. Bakteriyel yapışma 6 ve/veya 7 adımda açıklandığı gibi ölçmek. Ayrıca başında bitki materyali ile Kuluçka kuluçka ve hücrelerin hiçbir toksik kimyasal madde kuluçka sırasında mevcut sağlamak için kuluçka sonunda mevcut sayısı eklenen hücrelerin sayısını belirleyin. Cansız malzeme kullanın. Malzeme bitki üzerinde bakteriyel bağlılık görülen bir etkisi olup olmadığını belirlemek için cansız malzeme kullan bakteriyel bağlılık bitki veya bakteri üzerinde etkisi kaynaklanmaktadır. Hangi bakteri bağlamak ve okudu bitki materyali şekil ve boyut olarak benzer olduğu için cansız bir malzeme seçin. Filtre kağıtları her çeşit (selüloz, nitroselüloz, cam elyaf, polikarbonat, vb), konu (naylon, pamuk, polyester, cam yünü, vb), cam veya plastik coverslips, paslanmaz çelik Kuponlar ve diyaliz olanakları dahil membranlar. Cansız malzeme iyice su ve kuluçka yapılacaktır ve kullanmadan önce sterilize orta yıkayın. 8.2.1. adımda listelenen malzemelerin çoğu sterilizasyon ısıyla tarafından stabildir. 6 ve 7 numaralı adımlarda açıklandığı gibi puanı ve istenen koşulları altında cansız malzeme kuluçkaya. A. tumefaciens azaltılmış bağlama için kök tüyleri yüksek kalsiyum konsantrasyonlarda kaynaklanmaktadır belirlemek için naylon konu kullanımı örneği (en azından kısmen) kalsiyum bakteri üzerinde etkisi için Şekil 428içinde gösterilir.