Adhérence des bactéries à planter des Surfaces mesurées en laboratoire

1. préparation du matériel végétal axénique Préparer les plants cultivés dans l’eau. Placer un petit nombre de graines (moins de 30) dans un 30, 50, 100 ou carafe en verre 150 mL. Nous avons utilisé des tomates, luzerne, Arabidopsis thaliana, pois, haricots, tabac, laitue et graines de carotte avec ce protocole.Remarque : Pour déterminer combien de graines peut être stérilisés ensemble sans contamination s’étalant de semence d’une à l’autre, reportez-vous à l’étape 1.1.2. Couvrir les graines avec l’éthanol à 80 % et agiter brièvement. Laissez les graines tremper pendant 1 min. Décanter l’éthanol et de couvrir les graines avec une solution de 50 % de l’eau de Javel commerciale volume (NaClO) et 0,1 % Triton X-100 dans l’eau du robinet. Laissez les graines tremper pendant 20 min.Remarque : Si les graines sont volumineux, tels que les graines de haricot, il peut être nécessaire d’allonger la durée de trempage complètement tuer les champignons sur la surface de la graine. Décanter le mélange d’eau de Javel et lavez les graines 3 fois avec de l’eau stérile. Laissez les graines tremper dans l’eau pendant 1 minute pour chaque lavage. Pour obtenir des semis axéniques ajoutent une petite quantité d’eau stérile entre 5 et 25 mL selon la taille des graines. Versez les graines et l’eau dans une boîte de Petri stérile pour la germination des graines.NOTE : L’eau doit recouvrir le fond du plat mais pas couvrir les graines afin d’encourager la formation des poils absorbants. Axéniques décrit une culture dans laquelle seulement une seule espèce d’organisme est présente. Incuber dans l’obscurité jusqu’à ce que les plants atteignent la taille souhaitée entre 1 et 10 cm (environ 5 jours pour la tomate et a. thaliana et 1 à 3 jours pour la luzerne). Pour les plus grosses graines utiliser un récipient stérile couvert d’une capacité de plus de 100 mL, comme un plat en verre recouvert de papier. Déterminer la fréquence de contamination d’un lot de semences particulière avec les micro-organismes qui demeurent viables sur ou dans les graines après la stérilisation de la surface.NOTE : Ceci est nécessaire parce que les graines occasionnels transportent micro-organismes sous les téguments de la graine qui ne peut être tué par la surface-stérilisation. Utiliser la fréquence de graines contaminées dans un lot de semences pour déterminer combien de graines pour stériliser simultanément sans un risque élevé du groupe des graines contamination due à une seule graine par des bactéries ou des champignons qui survivent au traitement. Réalisez les étapes 1.1.1 à 1.1.3. Placer les graines sur une gélose nutritive Pétri. Mettre environ 10-30 graines dans chaque plat leur espacement afin qu’ils peuvent être marqués individuellement. Sceller les plats avec du ruban ou étanchéité film. Incuber pendant 3-5 jours à 25 ° C, marquant chaque jour pour l’excroissance visible des micro-organismes des graines. Préparer les plants cultivés dans du sable. Semis peuvent être cultivés dans le sable pour une utilisation dans des expériences de l’adhérence bactérienne. Réalisez les étapes 1.1.1 à 1.1.3. Stériliser le sable de quartz ou de la mer dans l’autoclave. Ces deux contiennent des matières organiques. Si cela va affecter l’expérience, laver le sable en le couvrant avec deux fois son volume de 0,1 M HCl. mélanger pendant 10 min. autoriser le sable pour s’installer et décanter le liquide. Rincer le sable 3 fois avec de l’eau, et une fois avec 80 % éthanol suivie deux rinçages ajoutant de l’eau en utilisant le même protocole que pour le 0,1 M HCl. stériliser le sable lavé dans l’autoclave. Stériliser les récipients en les immergeant dans bleach 50 % pendant 5 min et rincez-les 5 fois avec de l’eau stérile par submersion. Laissez-les sécher et sceller le fond avec film d’étanchéité. Le film obtenu à partir du fabricant est généralement exempt de micro-organismes à l’intérieur côté qui doit être placée face à l’intérieur du conteneur. Mélanger le sable stérile avec de l’eau assez stérile à humide, il suffit que les bâtons de sable. Le montant dépendra comment sécher le sable est. Généralement 10 à 35 % du volume de sable est suffisante. Placer le sable humide dans le bac permettant une profondeur suffisante pour la longueur des racines, espace nécessaire et suffisant au-dessus du sable pour la croissance de la pousse. Les distances exactes dépendent de l’espèce et la variété de plante utilisée. Graines de plantes. Faire un trou peu profond dans le sable avec une baguette de verre stérile juste assez profonde pour placer les semences sous la surface du sable (environ 1-5 mm). Placez les graines dans le trou. Recouvrir d’une fine couche de sable. Sceller le haut du conteneur avec étanchéité film afin d’éviter la perte d’eau et entrée de microbes supplémentaires. Cultiver les plantes en laboratoire sous une lumière ou dans la serre à une température appropriée et la durée du jour pour l’espèce et la variété de plante. Pour la tomate, luzerne ou Arabidopsis thaliana utilisent la température ambiante et cycles de lumière/obscurité de 12 h. Planter les semis dans un trou dans le sable (1-2 mm de diamètre et assez profondément que la racine est recouverts de sable). Faire le trou avec une baguette de verre stérile. Introduire la racine dans le trou à l’aide d’un stérile en acier inoxydable crochet si nécessaire et remplir les côtés du trou avec du sable. Vous pouvez également faire pousser des plantes axéniques sur ou dans la gélose contenant un mélange de sels tels que les sels de MS. Utiliser des pousses de plantes axéniques cultivées sur gélose directement. Éviter les racines cultivées avec agar comme agar adhère à la surface de la plante et les bactéries. Cela peut entraîner une fausse impression de l’adhérence bactérienne à la surface de la plante. 2. Elaboration d’autres matières végétales Laver les végétaux cultivé en serre avec de l’eau avant utilisation pour réduire le nombre de microbes indigènes. Il y aura des bactéries et des champignons sur les plantes. Protozoaires sera présent dans le sol, sur les racines et éventuellement sur les feuilles. Lavage avec eau de Javel ou de l’éthanol va modifier la surface de la plante et n’est pas recommandé. Si après lavage l’eau un nombre important de microbes reste, traiter les plantes avec un savon liquide dilué ou diluer l’eau oxygénée (0,01 %) d’enlever ou de tuer les microbes. C’est généralement moins dommageable pour la plante que l’eau de Javel ou de l’éthanol. Comme plante, matériel acheté sur un marché local est difficile à décontaminer, choisir le matériel qui ne semble pas avoir fait l’objet d’entreposage à long. Éviter les parties du matériau qui apparaissent marron ou endommagés. Laver à l’eau et faire des coupes fraîches sur les extrémités du matériau qui ont précédemment été coupées avant de l’utiliser, à moins que les interactions entre les bactéries de test avec les bactéries (et eucaryotes) qui aura accumulé à couper les sites présentent un intérêt. Ne pas laver avec eau de Javel ou de l’éthanol comme ils modifieront la surface de la plante. Traiter les sites de plaie. Sites de plaie offrent souvent des bactéries l’accès à l’intérieur de la matière végétale18. Bloquer ou réduire l’attachement des bactéries aux et le mouvement par le biais, plaie ou coupes sites créés lors de la préparation du matériel en trempant le bord coupé à la paraffine fondue ou en peignant le site avec de la paraffine fondue à l’aide d’une petite brosse. Ne pas utiliser une spatule ou tout mettre en œuvre forte car cela pourrait endommager le tissu. Joint tige cicatrices sur les fruits comme les tomates avec de la paraffine. Certaines bactéries seront nagées dans la zone située sous la paraffine, mais leur nombre est généralement de petite taille. Si une entrée bactérienne en sites de plaie présente un intérêt, estimation de la distance qui peuvent déplacer des bactéries transportée par les cours d’eau ou diffusion en observant le mouvement d’un colorant ajouté à la solution. Marquer des bactéries motiles en introduisant un gène codant pour une protéine fluorescente comme la protéine fluorescente verte (GFP) en eux et tracer à l’aide de la microscopie en fluorescence, décrit à l’étape 6.1.219. 3. préparation des bactéries Se développer les bactéries. Utiliser un support qui se rapproche de plus près les conditions, les bactéries sont susceptibles d’avoir été exposés au juste avant de rencontrer la plante dans le monde réel en dehors du laboratoire. Carbone et azote des sources ainsi que la présence d’ions, cations divalents particulièrement (Ca, Mg, Fe, Mn et Zn) et phosphate et le pH du milieu est importante. Utiliser un milieu minimal AB ou bouillon Luria pour a. tumefaciens et autres bactéries de sol20. Pour e. coli, qui peuvent être fournis dans le tube digestif, utiliser du bouillon de Luria. Ajouter inducteurs tels que les exsudats des racines ou des extraits de plantes commerciales telles que soytone ou sucres comme le saccharose ou le xylose à la moyenne de21. Si ces substances sont utilisées comme inducteurs, ajouter une concentration faible, par exemple de 0,01 %. Si elles sont sources de carbone utilisé, ajouter une concentration plus élevée, par exemple de 0,1 %. Préparation de l’inoculum bactérien. Diluer les bactéries dans l’eau stérile ou dans le milieu dans lequel l’incubation s’effectuera et ajoutez-les à la matière végétale. La dilution appropriée est examinée à l’étape 4.2 et 4.3. Pour retirer le support de croissance avant d’utiliser les bactéries, centrifuger la suspension bactérienne à 10 000 x g pendant 2 min, décanter le liquide surnageant et remettre en suspension les bactéries au vortex dans le même milieu qui sera utilisé pour l’incubation avec le matériel végétal. Cette méthode peut supprimer ou diminuer le nombre ou la quantité de matériel extracellulaire et appendices comme les exopolysaccharides, capsules, flagelles ou pili. S’il est important que ces structures de surface restent intacts, puis simplement diluer les bactéries avant d’inoculer les ou utiliser la méthode alternative indiquée au point 3.2.2. Comme méthode alternative pour enlever le milieu de culture, récolter les germes sur un filtre de nitrocellulose ou en polycarbonate avec une taille de pores de 0,2 µm ou moins. Laver les bactéries avec le milieu d’incubation et les remettre en suspension en agitant doucement ou vortex du filtre dans un contenant stérile du milieu. 4. l’inoculation de la bactérie Déterminer le nombre de bactéries à ensemencer en ce qui concerne la mesure de référence pour déterminer l’adhésion bactérienne et la durée de l’incubation. Pour les études microscopiques concernant l’incubation fois inférieure à 1 jour inoculer un nombre relativement élevé de bactéries. Ajouter un montant de culture pour atteindre une concentration bactérienne finale de plus de 106 bactéries / mL. Pour plus longues périodes d’incubation diminue la taille de l’inoculum bactérien. Pour les études dans lequel adhésion bactérienne sera mesurée par le nombre de cellules viables, ajouter un montant de culture pour atteindre une concentration bactérienne finale de 103 106 bactéries / mL. Évitez d’ajouter des bactéries tant que leur métabolisme modifie la concentration de pH ou de l’oxygène dans le milieu d’incubation. Mesurer le pH à l’aide de papier pH ou une électrode. Mesurer la concentration d’oxygène à l’aide d’une électrode à oxygène. Pour les plantes cultivées dans le sable, inoculer de trois manières possibles. Inoculer les semences avec les bactéries avant la plantation en faisant tremper les graines pendant 1 min en suspension dans l’eau environ 106 bactéries / mL. Ensemencer la racine par la germination des semis axéniques tel que décrit à l’article 1 et lorsque les racines des semis est environ 1 cm de long plongeant ou placer le Plant entier dans une suspension de 106 bactéries / mL dans l’eau pendant 1 min. Inoculer le sable par les bactéries de mélange avec le sable avant la plantation pour donner une concentration finale de 10 environ3 bactéries / mL ou en arrosant les plantules avec une suspension de 106 bactéries / mL après la plantation. 5. l’incubation des bactéries avec le matériel végétal Pour l’incubation dans un milieu liquide, incuber les bactéries avec le matériel végétal dans l’eau stérile ou de sels de sucrose et minérale ou végétale de milieu de culture tissulaire (par exemple un 01:10 dilution des sels MS)22,23. Utiliser un récipient à laquelle les bactéries n’adhèrent pas. Essayez de garder la surface de la plante en permanence couvert par immersion ou par agitation douce. Une agitation vigoureuse peut empêcher l’adhérence ou même éliminer les bactéries de la surface de la plante. Observer le matériel végétal au microscope après différents intervalles de temps pour déterminer le moment d’arrêter l’incubation et de faire des mesures. Une évolution temporelle de l’adhérence est souvent précieuse avec des échantillons prélevés toutes les 1 à 4 h ou tous les jours selon la vitesse de l’interaction. Pour incuber dans le sable, appliquer les mêmes considérations décrites à l’incubation dans un milieu liquide à l’étape 5.1. 6. mesure de l’adhérence à l’aide de la microscopie Effectuer des mesures microscopiques avec optique Nomarski ou contraste de phase pour le visionnement facile des bactéries sur des surfaces. Cependant, n’importe quel microscope en champ lumineux avec un grossissement de 20 X ou version ultérieure peut être utilisé. L’observation microscopique permet de déterminer si les bactéries sont aléatoirement distribués ou situés dans des sites spécifiques. Vérifiez également si elles sont tenues individuellement ou par groupes. Recherchez la présence de microcolonies suggérant la croissance bactérienne ou happé après adhésion. Vérifier si les bactéries semblent former un biofilm sur la surface.Remarque : Un biofilm est un grand nombre de bactéries à la surface et entouré d’une matrice extracellulaire23,24,25. La structure peut être lisse et uniforme ou avoir une architecture plus complexe. Méthodes pour l’étude des biofilms associés aux surfaces de la plante ont été décrits17. Utiliser des bactéries contenant le tag un marqueur fluorescent. Si les autres bactéries sont présentes et les bactéries d’intérêt sont identifiés par un marqueur fluorescent comme protéine fluorescente verte, utiliser la microscopie de fluorescence pour déterminer la présence de la bactérie étiquetée en grappes d’autres bactéries26. Pour GFP, utiliser un filtre avec une excitation 490 nm et d’émission à 520 nm. Vérifiez que la balise fluorescente n’affecte pas négativement les bactéries en observant l’adhérence au matériau axénique d’un mélange égal de bactéries de type sauvage et marqués de la même souche utilisant optique Nomarski et de fluorescence. Si les bactéries fluorescentes et sombres sont aléatoirement mixtes et présents en nombre égal, puis la balise n’interférence pas avec le test. Déterminer le nombre de bactéries fixées.Remarque : Il est très difficile de déterminer le nombre de bactéries fixées au microscope. Lorsque la liaison est à surfaces irrégulières végétales, il n’est généralement pas possible d’obtenir une mesure quantitative. Microscopie électronique (ne pas abordées dans cet article) peut être utilisé pour effectuer ces mesures. Lorsque les bactéries sont liés à une surface lisse comme un cheveu de la racine, compter le nombre de bactéries lié au bord de la chevelure de la racine par la longueur des poils absorbants mm. Prendre soin d’utiliser des poils absorbants d’à peu près la même taille et la forme en comparant les mesures. Pour déterminer la taille des objets dans le microscope, utilisez une diapositive commerciale avec marquages mesurées à ce sujet. Observer et photographier cette diapositive avec les mêmes paramètres que celui utilisé pour le matériel expérimental et utiliser les images obtenues pour déterminer la taille des objets dans les photomicrographies. Préparation des échantillons pour la microscopie. Laver l’échantillon. Passer l’échantillon à une goutte d’eau ou incubation moyen sur une lame de microscope et observer directement.NOTE : Ceci a l’avantage que si il n’y avait aucune croissance bactérienne ou la mort bactérienne réelle il n’est peu probable que beaucoup de bactéries libres. Prendre l’absence de bactéries libres comme un signe d’avertissement que peut il y avoir été mort bactérienne ou bactérienne liaison vers le conteneur dans lequel l’incubation a été réalisée. L’effet de l’échantillon de lavage est illustré à la Figure 1. Laver l’échantillon doucement dans l’eau ou incubation moyenne en le plaçant dans un flacon de liquide et en retournant le flacon doucement. Puis placez l’échantillon sur la lame de microscope en fraîche liquide pour l’observation. Monter l’échantillon dans un liquide à l’aide d’une lamelle couvre-objet ordinaire et une lame de microscope. Si l’échantillon est épais et donc ferait un renflement sous la lamelle couvre-objet, utilisez une lamelle de press-apply. Ces lamelles ont un anneau de caoutchouc ou de plastique autour du bord de la lamelle couvre-objet. Placer les échantillons et les liquides dans le puits de la lamelle couvre-objet et ensuite placer la lame sur le dessus et appuyez doucement pour sceller la lamelle couvre-objet de la diapositive. Inverser et examiner. Sinon utiliser une algue comptage de lame et lamelle couvre-objet de la même manière. Remarque qui se glisse avec cette profondeur ne peut généralement être examinée avec un objectif de plus de 20 X grossissement. Figure 1 : Les étapes de la préparation d’un échantillon pour déterminer le nombre de bactéries liés. A. tumefaciens liaison aux poils absorbants de tomate (A, B et C) et de fils de nylon (D, E et F). Dans les échantillons montés dans l’eau sans lavage tous les deux liés (flèches noires) les bactéries et les bactéries libres (flèches blanches) peuvent être vu (A et D). Après que lavage, que la bactérie liée demeure mais les bactéries libres ne sont plus présents (B et E). Après sonication les bactéries liées ont été retirés de la surface de l’échantillon (C et F). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Si les bactéries fluorescentes ont été utilisés, examiner l’échantillon au microscope après avoir retiré le sable. Racines de plantes cultivées dans le sable ne sont généralement pas appropriés pour la microscopie comme les particules de sable gênent l’observation des bactéries. Retirez la plante d’un conteneur de croissance selon les directives de l’étape 7. Placer les racines dans un récipient d’eau et mélanger doucement pour enlever le sable qui se déposent au fond du récipient. Retirer la plante de l’eau de lavage et monter l’échantillon comme au point 6.3.3. 7. mesure de l’adhérence à l’aide de cellules viables compte Déterminer le nombre de bactéries viables de joints en utilisant un sonicateur. Enlever les bactéries non liés. Placer l’échantillon dans un flacon avec suffisamment d’eau, lavage tampon ou incubation moyenne pour couvrir le matériel végétal et inverser la fiole plusieurs fois. S’il n’y a plus de 10 bactéries libres3 / mL présent lors de l’incubation initiale, effectuer des lavages séquentielles pour supprimer tous les. Vérifier au microscope optique (Voir l’étape 6.3) pour déterminer la présence de bactéries libres. Rincer jusqu’à ce qu’il y a une réduction substantielle du nombre de bactéries libres mais n’oubliez pas qu’il y a un équilibre entre les bactéries liées et non liées donc le nombre de bactéries libres ne peut jamais réduire à zéro. Retirer l’échantillon dans le flacon de lavage liquide avec une pince ou une spatule. Déterminer le nombre de bactéries liées dans des incubations de plantes dans un liquide. Suspendre l’échantillon lavé dans un flacon et couvrez-la avec un volume mesuré de l’eau, milieu d’incubation ou tampon de lavage. Utiliser suffisamment de liquide pour couvrir l’échantillon. Placer la fiole dans un sonicateur bain et laisser agir il pendant un min. Supprimer l’exemple et l’examiner sous microscope photonique pour déterminer si la bactérie liée ont été retirée de l’usine. L’élimination des bactéries d’un échantillon par sonication est illustrée à la Figure 1. S’il y a toujours lié bactéries présentes continuent sonification l’échantillon jusqu’à tel un temps pendant lequel aucune bactérie liée ne reste sur la surface de l’échantillon. Si la bactérie liée ne peut pas être supprimée par sonication, ajouter du sable de quartz stérile de 1 à 10 mg/mL et répétez la sonication et l’examen microscopique. Déterminer que la procédure de sonication qui semble plus efficace à l’étape 7.1.3.2 ne réduit pas la viabilité de la bactérie en suspendant des bactéries d’une culture liquide dans la solution à utiliser pour la sonication (ajouter du sable de quartz, si c’était nécessaire). Déterminer le nombre de cellules viables. Laisser agir la bactérie et déterminer le nombre de cellules viables à nouveau.Remarque : S’il y a une diminution du nombre de cellules viables, modifiez la procédure en modifiant la composition de l’époque sonication et/ou liquide jusqu’à ce que le traitement n’a aucun effet sur le nombre de cellules viables. Déterminer que le tampon de dilution utilisé pour le nombre de cellules viables n’altère pas la validité des bactéries qui ont été incubées dans les conditions utilisées en comparant le nombre de cellules viables réalisé à l’aide de tampons de différentes dilution et/ou d’eau. Déterminer le nombre de bactéries viables de joints à l’aide d’homogénéisation. Placer l’échantillon dans un mortier stérile ou mélangeur ou tout autre dispositif d’homogénéisation. Couvrez-la avec un volume mesuré de l’eau stérile, milieu d’incubation ou27de la mémoire tampon de lavage. Utiliser un volume suffisant pour couvrir l’échantillon. Pour un blender utiliser 100 mL. Broyer l’échantillon jusqu’à ce qu’elle soit bien homogène. Vérifier le pH après que homogénéisation pour être sûr qu’acide libérée des tissus végétaux n’a pas causé une chute de pH inférieur à 7. Si le pH a baissé utiliser un tampon comme un tampon de phosphate dans le liquide d’homogénéisation pour maintenir le pH. Déterminer le nombre de cellules viables. Utiliser des bactéries marquées avec la résistance aux antibiotique. Dans les cas où plus d’un type de bactérie est présent, marquer les souches bactériennes à l’aide de résistance spontanée aux antibiotiques (en général la rifampicine et à l’acide nalidixique). Déterminer le niveau de l’antibiotique à utiliser. S’il existent des cultures des autres organismes devrait être présent lors de l’incubation, plaque de ces cultures cultivées dans les conditions de l’incubation prévue avec des plantes sur des plaques contenant une gamme de concentrations de l’élu aux antibiotiques. Déterminer la concentration la plus faible qui ne permet pas la croissance de le quelconque de ces organismes. Il s’agit de la plus faible concentration d’antibiotique auquel la bactérie test devra être résistant. Obtenir des mutants résistants aux antibiotiques spontanés. Atteindre une culture de la bactérie en milieu riche fin journal ou de la phase stationnaire. Plaque 0,1 mL non dilué sur une plaque contenant l’antibiotique désiré à une concentration appropriée. Déterminer les concentrations d’utiliser tel que décrit à l’étape 7.3.1.1. Conservez et purifier les bactéries qui se développent et sont donc résistants à l’antibiotique. Déterminer que la résistance aux antibiotique ne réduit pas la croissance des bactéries en faisant une courbe de croissance dans un milieu liquide de la société mère et les souches résistantes aux antibiotiques. Déterminer que les bactéries résistantes aux antibiotiques montrent le même niveau de colonisation du matériel végétal axéniques comme la souche parentale, si cela est possible. Déterminer le nombre de bactéries viables lié aux plantes cultivées dans le sable. Retirer la plante du conteneur et sable. Pour supprimer les plantes de conteneurs, retirez d’abord matériau d’étanchéité sur le dessus et le fond du récipient. Placer le récipient sur un morceau de papier stérile et retirer doucement le sable ensemble ou le sol et la plante comme un grand cylindre conique en frappant doucement le récipient contre une surface pour desserrer le matériel. Si nécessaire, utilisez une spatule ou une tige pour desserrer le matériau autour des bords traverse le fond du récipient. Quand la bouteille de sable ou de terre contenant la plante est libre sur le papier, il fendu par le milieu pour révéler la racine de la plante. Si vous le souhaitez, prélever des échantillons de sable de près du bord du conteneur ainsi que près de la racine. Cela peut être utile pour déterminer la propagation (et accumulation et la croissance) de la bactérie. Mesurez la longueur de la racine. Prenez la racine et enlever le sable et les bactéries adhérant plus ou moins à la racine (le matériel de la rhizosphère) par trempage de la racine dans un volume mesuré de l’eau ou de la mémoire tampon et secouant doucement. Déterminer le nombre de cellules viables de bactéries dans la suspension obtenue par culture sur un milieu approprié comme la gélose Luria. Cela représente le nombre de bactéries faiblement associés à la racine. Enlever les bactéries étroitement liés par sonication et déterminer leur nombre comme indiqué au point 7.1. Sinon, pour déterminer l’emplacement sur la racine des bactéries étroitement liés placer la racine lavée sur la surface d’une boîte de Pétri contenant la gélose nutritive ou autre moyen approprié. Observez l’emplacement des colonies bactériennes sur la racine sur les 3 prochains jours à l’aide d’un microscope à dissection ou une loupe. Exprimer les résultats sous forme de nombre de bactéries par plante, par cm2 de surface, par la longueur des racines cm ou par gramme de poids frais de tissu. Faire des répétitions multiples sur le même jour et aussi faire des répétitions à des jours différents à l’aide de différentes cultures bactériennes et différents lots de matières végétales. 8. déterminer si l’effet des conditions d’incubation sur l’adhérence est due à une réponse de la bactérie ou la plante Utiliser des végétaux morts ou tués. Sous réserve de l’usine de matériel d’une variété de produits chimiques, fixatifs ou d’autres traitements comme la chaleur afin de le tuer. Laver soigneusement le matériel végétal dans le milieu de l’eau et d’incubation après l’utilisation de le quelconque de ces traitements. Alors inoculer la bactérie. Cela ne détruira pas la surface de la plante, mais il fera métaboliquement inactives afin qu’il ne peut pas répondre à la bactérie. Mesurer l’adhérence bactérienne comme décrit aux étapes 6 et 7. Également déterminer le nombre de cellules viables, ajouté à l’incubation avec le matériel végétal au début de l’incubation et le nombre de cellules viables présents à la fin de l’incubation pour s’assurer qu’aucune substance chimique toxique n’était présents lors de l’incubation. Utiliser des matières inanimées. Adhérence des bactéries utilisation de matériaux inanimé pour déterminer si un effet observé sur l’adhérence des bactéries à la matière végétale est due à un effet sur les plantes ou les bactéries. Choisissez une matière inanimée à laquelle lient les bactéries et qui est semblable dans la forme et la taille pour le matériel végétal étudié. Les possibilités incluent papier-filtre de tous types (cellulose, nitrocellulose, fibre de verre, polycarbonate, etc..), fils (nylon, coton, polyester, laine de verre, etc..), verre ou lamelles couvre-objet en plastique, acier inoxydable coupons et dialyse membranes. Laver la matière inanimée soigneusement à l’eau et le milieu dans lequel l’incubation s’effectuera et stériliser avant usage. La plupart des matières énumérées à l’étape 8.2.1 est stable à la stérilisation à l’autoclave. Incuber la matière inanimée sous les conditions souhaitées et le score comme décrit aux étapes 6 et 7. Un exemple de l’utilisation de filets en nylon pour déterminer que la liaison réduite d’a. tumefaciens aux poils absorbants à des concentrations de calcium élevé est due (au moins en partie) à un effet du calcium sur les bactéries est indiqué à la Figure 428.