Einhaltung von Bakterien auf Flächen, die im Labor ermittelten Pflanzen

1. Vorbereitung des Axenic Pflanzenmaterial Bereiten Sie Setzlinge in Wasser gewachsen. Legen Sie eine kleine Anzahl von Samen (weniger als 30) in einem 30, 50, 100 oder 150 mL Becherglas. Wir haben Tomaten, Luzerne, Arabidopsis Thaliana, Erbsen, Bohnen, Tabak, Salat und karottensamen mit diesem Protokoll verwendet.Hinweis: Um festzustellen, wie viele Samen ohne Verunreinigung aus einem Samenkorn zum anderen verbreiten zusammen sterilisiert werden können, siehe Schritt 1.1.2. Bedecken Sie die Samen mit 80 % igem Ethanol und kurz schwenken. Lassen Sie die Samen für 1 min einweichen. Gießen Sie das Ethanol und bedecken Sie die Samen mit einer Lösung aus 50 % durch Volumen kommerzielle Bleichmittel (NaClO) und 0,1 % Triton x-100 im Leitungswasser. Lassen Sie die Samen für 20 Minuten einweichen.Hinweis: Wenn die Samen groß, wie z. B. Bohnensamen sind, möglicherweise es verlängert die Einwirkzeit um die Pilze auf der Oberfläche der Samen vollständig zu töten. Die Bleichmittel Mischung abgießen und die Samen 3 Mal mit sterilem Wasser zu waschen. Lassen Sie die Samen in Wasser für 1 min für jede Wäsche einweichen. Um zu erhalten fügen axenic Sämlinge eine kleine Menge steriles Wasser zwischen 5 und 25 mL je nach Größe der Samen. Gießen Sie die Samen und Wasser in eine sterile Petrischale für die Keimung der Samen.Hinweis: Sollte das Wasser bedecken Sie den Boden der Schale aber nicht decken die Samen um die Bildung der Wurzelhaare zu fördern. Axenic beschreibt eine Kultur, in der nur eine einzige Art des Organismus vorhanden ist. Inkubieren Sie im Dunkeln, bis die Sämlinge die gewünschte Größe zwischen 1 cm und 10 cm (ca. 5 Tage für Tomaten und A. Thaliana und 1 bis 3 Tage für Luzerne) erreichen. Verwenden Sie für größere Samen einen überdachten sterilen Behälter mit einem Fassungsvermögen von mehr als 100 mL wie eine Glasschale mit Folie abgedeckt. Bestimmen Sie die Frequenz der Kontamination von einem bestimmten Saatgutpartie mit Mikroorganismen, die auf oder innerhalb der Samen nach der Oberfläche-Sterilisation Lebensfähigkeit.Hinweis: Dies ist notwendig, da gelegentliche Samen Mikroorganismen unter der Samenschale tragen, die durch Oberfläche-Sterilisation nicht getötet werden kann. Verwenden Sie die Häufigkeit der kontaminierten Samen in einer Saatgutpartie um zu bestimmen, wie viele Samen um zu sterilisieren auf einmal ohne ein hohes Risiko für die Gruppe der Samen immer kontaminiert durch einen Samen mit Bakterien oder Pilzen, die die Behandlung überleben. Führen Sie Schritte 1.1.1 bis 1.1.3. Legen Sie die Samen auf ein Nähragar Petrischale. Habe ca. 10-30 Samen in jedem Gericht Abstand so dass sie einzeln bewertet werden können. Versiegeln Sie die Gerichte mit Klebeband oder Abdichtung Film. Ca. 3-5 Tage bei 25 ° C erzielte täglich sichtbaren Auswuchs von Mikroorganismen aus den Samen inkubieren. Bereiten Sie Setzlinge in Sand angebaut. Setzlinge können im Sand für den Einsatz in bakterielle Adhäsion Experimente. Führen Sie Schritte 1.1.1 bis 1.1.3. Sterilisieren Sie Quarz oder Meer Sand in den Autoklaven. Beide enthalten einige organisches Material. Wenn dies das Experiment auswirkt, waschen Sie den Sand durch abdecken mit zweimal sein Volumen von 0,1 M HCl. Mix für 10 min. erlauben den Sand zum absetzen und die Flüssigkeit abgießen. Spülen Sie den Sand 3 Mal mit Wasser und einmal mit 80 % Ethanol gefolgt von zwei zusätzlichen Wasser spült mit dem gleichen Protokoll wie bei 0,1 M HCl. entkeimen die gewaschenen Sand in den Autoklaven. Sterilisieren von Containern durch Untertauchen sie in 50 % Bleichmittel für 5 min und spülen Sie sie 5-Mal mit sterilem Wasser durch Untertauchen. Damit sie trocknen und Dichtung unten mit dichten Film. Der Film, wie vom Hersteller zu beziehen ist in der Regel frei von Mikroorganismen auf der Innenseite Seite, die mit Blick auf das Innere des Containers platziert werden soll. Mischen Sie die sterilen Sand mit genug sterilem Wasser bis es nass genug, dass die Sand-Sticks. Die Höhe hängt davon ab, wie trocken der Sand ist. 10-35 % des Volumens des Sandes ist in der Regel ausreichend. Legen Sie den nassen Sand in den Behälter so dass ausreichend Tiefe für die Länge der Wurzeln notwendig und ausreichend Raum über dem Sand für das Wachstum des Sprosses. Die genauen Abstände richten sich nach Art und Sorte der Pflanze verwendet wird. Pflanzensamen. Stellen Sie ein flaches Loch in den Sand mit einem sterilen Glasstab nur tief genug, um das Saatgut unter der Oberfläche des Sandes (ca. 1-5 mm) platzieren. Legen Sie die Samen in das Loch. Bedecken Sie es mit einer dünnen Schicht von Sand. Verschließen Sie den oberen Rand des Containers mit Abdichtung Film um Wasserverlust und Eingang der zusätzlichen Mikroben zu verhindern. Wachsen Sie die Pflanzen im Labor unter einem Licht oder im Gewächshaus bei geeigneter Temperatur und Tageslänge für Art und Sorte der Pflanze. Verwenden Sie für Tomaten, Luzerne oder Arabidopsis Thaliana Raumtemperatur und 12 h hell/dunkel-Zyklen. Pflanzen Sie die Setzlinge in ein Loch in den Sand (ca. 1-2 mm im Durchmesser und tief genug, dass die Wurzel mit Sand abgedeckt werden). Machen Sie das Loch mit einem sterilen Glasstab. Führen Sie die Wurzel vorsichtig in das Loch mit einer sterilen Edelstahl Häkelnadel wenn benötigt wird und die Seiten des Loches mit Sand zu füllen. Alternativ, wachsen Sie Pflanzen axenically auf oder im Agar enthält eine Mischung von Salzen wie z. B. MS Salze. Verwenden Sie Triebe der axenic Pflanzen in Agar direkt. Vermeiden Sie Wurzeln gewachsen mit Agar Agar klebt an der Pflanzenoberfläche und die Bakterien. Dadurch kann ein falscher Eindruck von bakterielle Adhäsion auf der Pflanzenoberfläche. 2. Vorbereitung des anderen pflanzlichen Material Waschen Sie Pflanzenmaterial im Gewächshaus mit Wasser vor dem Gebrauch die Reduzierung der indigenen Mikroben angebaut. Es werden Bakterien und Pilze auf die Pflanzen. Protozoen werden im Boden, an den Wurzeln, und möglicherweise auf den Blättern vorhanden sein. Waschen mit Bleichmittel oder Ethanol ändert der Pflanzenoberfläche und wird nicht empfohlen. Sollte nach Wasserreinigung bedeutende Zahlen von Mikroben bleiben, behandeln die Pflanzen mit verdünnten flüssigen Handseife oder Wasserstoffperoxid (0,01 %) zu entfernen oder zu töten Mikroben zu verdünnen. Dies ist in der Regel weniger schädlich für die Pflanze als Bleichmittel oder Ethanol. Als Pflanze ist auf einem lokalen Markt gekauften Materials schwierig zu dekontaminieren, wählen Material, das nicht angezeigt wird, zu lange Lagerung unterzogen wurden. Vermeiden Sie Teile des Materials, die braune oder beschädigt angezeigt. Waschen Sie ihn mit Wasser und frische Schnitte an den Enden des Materials die zuvor geschnitten worden sind, bevor Sie es verwenden, es sei denn, schneiden Sie die Wechselwirkungen der testbakterien mit Bakterien (und Eukaryoten) die auf angesammelt haben, werden Websites von Interesse sind. Waschen Sie nicht mit Bleichmittel oder Ethanol, wie sie der Pflanzenoberfläche verändern werden. Websites der Wunde zu behandeln. Wunde Seiten bieten oft Bakterien Zugang in das Innere der Pflanze Material18. Blockieren Sie oder verringern Sie bakterielle Bindung an und Bewegung durch Wunde oder geschnittenen Websites erstellt bei der Vorbereitung des Materials durch die Schnittkante in geschmolzenem Paraffin eintauchen oder durch die Website mit geschmolzenem Paraffin mit einem kleinen Pinsel malen. Verwenden Sie keinem Spatel oder irgendwelche scharfen umzusetzen, da dies das Gewebe beschädigen kann. Siegel stammen Narben auf Früchte wie Tomaten mit Paraffin. Einige Bakterien werden in den Bereich unter dem Paraffin Schwimmen, aber ihre Zahlen sind in der Regel klein. Wenn bakterielle Inkrafttreten Wunde Websites von Interesse, Schätzung, die Distanz, die Bakterien gelangen durch Wasserläufe oder Diffusion ausgeführt, wird durch die Beobachtung der Bewegung eines Farbstoffes der Projektmappe hinzugefügt. Markieren Sie bewegliche Bakterien durch die Einführung eines Gens Codierung ein fluoreszierendes Protein wie grün fluoreszierendes Protein (GFP) hinein und sie verfolgen mit Fluoreszenz-Mikroskopie 6.1.2 Schritt19beschrieben. 3. Vorbereitung der Bakterien Wachsen Sie die Bakterien. Verwenden Sie ein Medium, das am ehesten die Bedingungen der Bakterien approximiert werden voraussichtlich die ausgesetzt worden sind, unmittelbar vor der Begegnung mit dem Werk in der realen Welt außerhalb des Labors. Kohlenstoff und Stickstoff Quellen sowie die Anwesenheit von Ionen, insbesondere zweiwertigen Kationen (Ca, Mg, Fe, Mn und Zn) und Phosphat und der pH-Wert des Mediums sind wichtig. Verwenden Sie minimal AB Mittel “oder” Luria Brühe für A. Tumefaciens und andere Boden-Bakterien-20. Verwenden Sie für E. Coli, die im Darm entstehen können, Luria Brühe. Die mittlere21Induktoren z. B. Wurzelausscheidungen oder kommerzielle Pflanzenextrakte wie Soytone oder Zucker wie Saccharose oder Xylose hinzufügen. Wenn diese Stoffe als Induktoren verwendet werden, fügen Sie eine niedrige Konzentration, z. B. 0,01 %. Wenn sie gebrauchte Kohlenstoffquellen sind, fügen Sie eine höhere Konzentration, z. B. 0,1 %. Bereiten Sie das bakterielle Inokulum. Verdünnen Sie die Bakterien in sterilem Wasser oder das Medium, in dem die Inkubation wird nachgeholt, und fügen sie Sie das Pflanzenmaterial. Die entsprechende Verdünnung wird in Schritten 4.2 und 4.3 diskutiert. Um die Wachstumsmedien entfernen, bevor die Bakterien, die Bakteriensuspension bei 10.000 x g für 2 min zentrifugieren, überstand abgießen und Aufschwemmen der Bakterien durch Vortexen Sie in das gleiche Medium, welches für die Inkubation mit dem Pflanzenmaterial verwendet wird. Diese Methode kann zu entfernen oder verringern Sie die Anzahl oder Menge der extrazellulären Material und Anhängsel wie exopolysaccharide, Kapseln, Geißeln und/oder Pili. Wenn es wichtig ist, dass diese Oberflächenstrukturen intakt bleiben, dann einfach verdünnen Sie die Bakterien zu, bevor sie impfen oder verwenden Sie die alternative Methode, die im Schritt 3.2.2 beschrieben. Als eine alternative Methode zum Entfernen Wachstumsmedium, sammeln Sie die Bakterien auf einem Nitrozellulose oder Polycarbonat Filter mit einer Porengröße von 0,2 µm oder weniger. Waschen Sie die Bakterien mit dem Medium Inkubation und Aufschwemmen sie durch sanftes schütteln oder aufschütteln des Filters in einen sterilen Behälter des Mediums. 4. Impfung der Bakterien Bestimmen Sie die Anzahl der Bakterien unter Bezugnahme auf die Messung verwendet werden, um festzustellen, bakterielle Adhäsion geimpft werden und die Dauer der Inkubation. Mikroskopische Studien mit Inkubation mal weniger als 1 Tag sind relativ große Anzahl von Bakterien zu impfen. Fügen Sie eine Menge an Kultur, eine bakterielle Endkonzentration von mehr als 106 Bakterien pro mL zu erreichen. Für längere Inkubationszeiten verkleinern Sie bakterielle Inokulum. Für Studien, in denen bakterielle Adhäsion wird daran gemessen werden tragfähige Zellzahlen, fügen Sie eine Menge an Kultur, eine bakterielle Endkonzentration von 10 zu erreichen3 bis 106 Bakterien pro mL. Vermeiden Sie so viele Bakterien, dass ihr Stoffwechsel ändert sich die pH-Wert oder Sauerstoff-Konzentration im Inkubation Medium hinzufügen. PH-Wert mit pH-Papier oder einer Elektrode zu messen. Sauerstoff-Konzentration mit einer Sauerstoffelektrode zu messen. Für Pflanzen in Sand in drei mögliche Wege zu impfen. Impfen Sie die Samen mit den Bakterien vor der Pflanzung durch Einweichen der Samen für 1 min in einer Suspension in Wasser etwa 106 Bakterien pro mL. Die Wurzel von axenic Sämlinge Keimen, wie in Abschnitt 1 beschrieben, als Sämling Root ist etwa 1 cm lang eintauchen oder die ganze Sämling in eine Suspension von 106 Bakterien pro mL Wasser für 1 min zu impfen. Impfen Sie Sand, durch Mischen der Bakterien mit dem Sand vor dem Einpflanzen um eine Endkonzentration von etwa 103 Bakterien pro mL zu geben oder durch Bewässerung des Keimlings mit einer Suspension von 106 Bakterien pro mL nach der Pflanzung. (5) Inkubation der Bakterien mit dem Pflanzenmaterial Für die Inkubation in flüssigen Medien, brüten die Bakterien mit dem Pflanzenmaterial in sterilem Wasser oder Saccharose und mineralische Salze oder pflanzlichen Gewebe Kulturmedium (z. B. eine 01:10 Verdünnung MS Salze)22,23. Verwenden Sie einen Behälter, auf dem sich die Bakterien nicht halten. Versuchen zu der Pflanzenoberfläche bedeckt kontinuierlich durch Eintauchen oder durch sanfte Bewegung. Kräftig schütteln kann verhindern Haftung oder sogar Bakterien aus der Pflanzenoberfläche entfernen. Beobachten Sie das Pflanzenmaterial in dem Lichtmikroskop nach unterschiedlichen Zeitintervallen zu bestimmen, wann man aufhören die Inkubation und Messungen machen. Ein zeitlichen Verlauf der Adhäsion ist oft wertvolle mit Proben, die jeweils 1 bis 4 h oder jeden Tag abhängig von der Geschwindigkeit der Interaktion. Um im Sand zu inkubieren, gelten Sie die gleichen Überlegungen zur Inkubation im flüssigen Medium im Schritt 5.1 beschrieben. 6. Messung der Adhäsion mit Mikroskopie Machen Sie mikroskopische Messungen mit Nomarski oder Phasenkontrast-Optiken für die einfache Anzeige der Bakterien auf Oberflächen. Jedoch kann jedes Hellfeld Mikroskop mit Vergrößerung von 20 X oder höher verwendet werden. Verwenden Sie mikroskopische Beobachtung, um festzustellen, ob die Bakterien sind nach dem Zufallsprinzip verteilt oder in bestimmte Websites. Auch überprüfen Sie, ob sie einzeln oder in Büscheln gebunden sind. Achten Sie auf das Vorhandensein von mikrokolonien was bakterielles Wachstum oder Einklemmung nach Haftung. Überprüfen Sie, ob die Bakterien scheinen einen Biofilm auf der Oberfläche bilden.Hinweis: Ein Biofilm ist eine große Anzahl von Bakterien an der Oberfläche gebunden und umgeben von einer extrazellulären Matrix23,24,25. Die Struktur kann glatt und gleichmäßig oder haben eine kompliziertere Architektur. Methoden zur Untersuchung von Biofilms pflanzlicher Oberflächen zugeordnet wurden beschrieben17. Verwenden Sie Bakterien, die mit einem fluoreszierenden Marker markiert. Wenn andere Bakterien vorhanden sind, und die Bakterien von Interesse werden durch einen fluoreszierenden Tag wie z. B. grün fluoreszierendes Protein identifiziert, verwenden Sie Fluoreszenz-Mikroskopie um zu bestimmen, das Vorhandensein von tagged Bakterien in Clustern mit andere Bakterien-26. Verwenden Sie für GLP einen Filter mit 490 nm Anregung und 520 nm Emission. Überprüfen Sie, dass das fluoreszierende Tag nicht die Bakterien beeinträchtigt ist durch die Beobachtung der Einhaltung von axenic Material eine gleiche Mischung von Wildtyp-Bakterien und tagged Bakterien von dem gleichen Stamm mit Nomarski und Fluoreszenz-Optik. Wenn die fluoreszierenden und dunklen Bakterien nach dem Zufallsprinzip gemischt und in gleicher Anzahl vorhanden sind der Tag mit dem Assay nicht stören. Bestimmen Sie die Anzahl der angeschlossenen Bakterien.Hinweis: Es ist sehr schwierig, die Anzahl der angeschlossenen Bakterien im Mikroskop bestimmen. Wenn die Bindung zu unregelmäßigen pflanzlicher Oberflächen ist, ist es in der Regel nicht möglich, eine quantitative Messung zu erhalten. Rasterelektronenmikroskopie (nicht in diesem Artikel beschriebenen) kann verwendet werden, um solche Messungen zu machen. Wenn die Bakterien zu einer glatten Oberfläche wie ein Wurzelhaare gebunden sind, die Anzahl der Bakterien an den Rand der Wurzelhaare pro mm Wurzelhaare Länge gebunden. Achten Sie darauf, um Wurzelhaare etwa die gleiche Größe und Form im Vergleich zu verwenden. Um die Größe von Objekten im Mikroskop zu bestimmen, verwenden Sie eine kommerzielle Folie mit gemessenen Markierungen drauf. Beobachten Sie und fotografieren Sie diese Folie auf die gleichen Einstellungen wie für das experimentelle Material verwendet und verwenden Sie die dabei entstandenen Bilder, um festzustellen, die Größe der Objekte in die Vergößerung. Bereiten Sie die Probe für die Mikroskopie. Waschen Sie die Probe. Bewegen Sie die Probe in einem Tropfen Wasser oder Inkubation Medium auf einen Objektträger zu und beobachten Sie es direkt.Hinweis: Dies hat den Vorteil, dass gäbe es kein Bakterienwachstum oder bakterielle Tod es unwahrscheinlich viele freie Bakterien sein. Nehmen Sie das Fehlen von freien Bakterien als ein Warnzeichen, dass möglicherweise wurden bakterielle Tod oder bakterielle Bindung an den Container, in dem die Inkubation durchgeführt wurde. Die Wirkung des Waschens der Probenmaterials ist in Abbildung 1dargestellt. Waschen Sie die Probe vorsichtig in Wasser oder Inkubation Medium indem man es in ein Fläschchen mit Flüssigkeit und invertieren das Fläschchen vorsichtig. Dann legen Sie die Probe auf die Objektträger in frische Flüssigkeit zur Beobachtung. Montieren Sie die Probe in Flüssigkeit mit einem gewöhnlichen Deckglas und Mikroskop-Objektträger. Verwenden Sie wenn die Probe dick ist und so eine Beule unter dem Deckglas machen würde, ein Press-apply Deckglas. Diese Abdeckung Slips haben einen Ring aus Kautschuk oder Kunststoff am Rand des Deckglases. Legen Sie die Flüssigkeit und die Probe in den Brunnen in das Deckglas und dann legen Sie die Folie an der Spitze und drücken Sie an, um das Deckglas auf die Folie zu versiegeln. Umkehren und zu untersuchen. Alternativ verwenden Sie eine Alge, die Rutsche und Deckglas in ähnlicher Weise zu zählen. Beachten Sie, dass Folien mit dieser Tiefe können nicht generell mit einem Objektiv von mehr als 20 X Vergrößerung untersucht werden. Abbildung 1 : Schritte bei der Vorbereitung einer Probe zur Bestimmung der Anzahl der gebundenen Bakterien. A. Tumefaciens Bindung Tomate Wurzelhaare (A, B und C) und Nylonfäden (D, E und F). In Proben im Wasser montiert, ohne Waschen beides Bakterien (Schwarze Pfeile) gebunden und freie Bakterien (weisse Pfeile) zu sehen (A und D). Nach dem Waschen die gebundenen Bakterien bleiben aber die freie Bakterien sind nicht mehr vorhanden (B und E). Nach Anwendung von Ultraschall wurden die gebundenen Bakterien von der Probenoberfläche (C und F) entfernt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Wenn fluoreszierende Bakterien verwendet wurden, untersuchen Sie die Probe unter dem Mikroskop nach der Sand entfernt worden ist. Wurzeln der Pflanzen in Sand sind in der Regel nicht geeignet für Mikroskopie, als die Beobachtung der Bakterien die Sandpartikel stören. Entfernen Sie die Pflanze von einem Wachstum Container nach Schritt 7. Legen Sie die Wurzeln in ein Gefäß mit Wasser und mischen Sie vorsichtig, um den Sand zu entfernen, die auf den Boden des Behälters absetzen wird. Entfernen Sie die Pflanze aus dem Waschwasser und montieren Sie die Probe wie in Schritt 6.3.3. 7. Messung der Adhäsion mit lebensfähigen Zelle zählt Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen beigefügten Bakterien mit einem sonikator. Die ungebundenen Bakterien zu entfernen. Legen Sie die Probe in ein Fläschchen mit ausreichend Wasser, Puffer oder Inkubation waschmedium bedecken das Pflanzenmaterial und invertieren das Fläschchen einige Male. Gäbe es mehr als 103 freie Bakterien pro mL in der ersten Inkubation vorhanden, führen Sie sequentielle Waschungen um alle zu entfernen. Check-in einem Lichtmikroskop (siehe Punkt 6.3) auf das Vorhandensein von Bakterien frei bestimmen. Waschen, bis es eine erhebliche Verringerung der Zahl der freien Bakterien gibt, aber denken Sie daran, dass es ein Gleichgewicht zwischen gebundenen und ungebundenen Bakterien so die Anzahl der freien Bakterien nie auf Null sinken kann. Entfernen Sie die Probe aus dem Fläschchen der Waschflüssigkeit mit einer Zange oder einem Spachtel. Bestimmen Sie die Anzahl der gebundenen Bakterien in Inkubationen von Pflanzen in Flüssigkeit. Auszusetzen Sie die gewaschene Probe in einer Durchstechflasche und bedecken Sie es mit einem gemessenen Volumen von Wasser, Inkubation Medium oder waschen Puffer. Verwenden Sie genügend Flüssigkeit, um die Probe abzudecken. Legen Sie das Fläschchen in einem Bad sonikator und für eine min beschallen. Entfernen Sie die Probe und prüfen sie unter dem Lichtmikroskop zu bestimmen, ob die gebundenen Bakterien aus der Anlage entfernt wurden. Die Entfernung von Bakterien aus einer Stichprobe durch Ultraschallbehandlung ist in Abbildung 1dargestellt. Gibt es noch vorhandenen Bakterien gebunden weiter beschallen die Probe bis so eine Zeit, die keine gebundenen Bakterien auf der Oberfläche der Probe bleiben. Wenn die gebundenen Bakterien durch Ultraschallbehandlung entfernt werden können, fügen Sie 1 bis 10 mg/mL sterile Quarzsand und wiederholen Sie die Anwendung von Ultraschall und mikroskopische Untersuchung. Bestimmen, dass die Beschallung-Verfahren, das am effektivsten im Schritt 7.1.3.2 erscheint die Aussetzung von Bakterien aus einer Flüssigkultur in der Lösung für Beschallung verwendet werden nicht die Lebensfähigkeit der Bakterien verringert (Quarzsand, fügen, wenn es nötig war). Bestimmen Sie die Zellenanzahl der lebensfähigen. Beschallen Sie die Bakterien und bestimmen Sie die Zellenanzahl der lebensfähigen wieder.Hinweis: Ist ein Rückgang der Anzahl der lebensfähigen Zellen, ändern Sie das Verfahren durch eine Änderung der Zusammensetzung der Flüssigkeit und/oder Beschallung Zeit, bis die Behandlung keinen Einfluss auf die Anzahl der lebensfähigen Zellen hat. Bestimmen Sie, dass die Verdünnungspuffer für tragfähige zellenzahlen verwendet die Lebensfähigkeit der Bakterien nicht beeinflusst, die unter den Bedingungen verwendet, durch den Vergleich von lebensfähigen Zellzahlen unter Verwendung unterschiedlicher Verdünnung Puffer und/oder Wasser inkubiert worden. Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen beigefügten Bakterien mit Homogenisierung. Legen Sie die Probe in einem sterilen Mörser oder Mixer oder ein anderes Gerät Homogenisierung. Bedecken Sie es mit einem gemessenen Volumen von sterilem Wasser, Inkubation Mittel oder waschen Puffer27. Verwenden Sie ein Volumen die Probe zu decken. Verwenden Sie für einen Mixer 100 mL. Schleifen Sie die Probe, bis es gut homogenisiert wird. Überprüfen Sie den pH-Wert nach Homogenisierung sicher sein, dass Säure befreit das Pflanzengewebe einen drastischen Einbruch pH-Wert unter 7 nicht verursacht hat. Wenn der pH-Wert gesunken verwenden Sie einen Puffer wie Phosphatpuffer in der Homogenisierung Flüssigkeit um den pH-Wert beizubehalten. Bestimmen Sie die Zellenanzahl der lebensfähigen. Verwenden Sie Bakterien mit Antibiotika-Resistenz gekennzeichnet. Markieren Sie in Situationen, in denen mehr als eine Art von Bakterium vorhanden ist Bakterienstämme mit spontanen Widerstand gegen Antibiotika (in der Regel Rifampicin und Nalidixic Säure). Bestimmen Sie das Antibiotikum zu verwenden. Wenn Kulturen anderer Organismen, die voraussichtlich in die Inkubation vorkommen verfügbar sind, Platte dieser Kulturen angebaut unter den Bedingungen der beabsichtigten Inkubation mit Pflanzen auf Platten, die eine Reihe von Konzentrationen der gewählten Antibiotika. Bestimmen Sie die niedrigste Konzentration, die Wachstum aller dieser Organismen nicht zulässt. Dies ist die niedrigste Konzentration des Antibiotikums, die testbakterien resistent sein müssen. Erhalten Sie spontane Antibiotika-resistenten Mutanten. Wachsen Sie eine Kultur des Bakteriums in reiche Mittel zu spät Log oder stationären Phase. Platte 0,1 mL unverdünnt auf einen Teller, die das gewünschte Antibiotikum bei einer entsprechenden Konzentration enthalten. Bestimmen Sie die Konzentrationen zu verwenden, wie in Schritt 7.3.1.1 beschrieben. Zu halten und die Bakterien, die wachsen und somit resistent gegen das Antibiotikum zu reinigen. Bestimmen Sie, dass Antibiotika-Resistenz nicht das Wachstum der Bakterien reduziert auf diese Weise eine Wachstumskurve im flüssigen Medium der übergeordneten und Antibiotika-resistente Stämme. Bestimmen Sie, dass die Antibiotika-resistente Bakterien das gleiche Maß an Besiedlung des axenic Pflanzenmaterial als Elternstamm, zeigen wenn dies möglich ist. Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Bakterien an Pflanzen in Sand gebunden. Entfernen Sie die Pflanze aus dem Container und Sand. Um Pflanzen aus Behältern zu entfernen, entfernen Sie zunächst Dichtungsmaterial auf der Ober- und Unterseite des Behälters. Stellen Sie den Behälter über einen Zettel steril und entfernen Sie vorsichtig den gesamten Sand oder Boden und Pflanze als eine große konische Zylinder durch sanft klopfen die Container gegen eine Fläche um das Material zu lösen. Verwenden Sie ggf. einen Spatel oder Stab, um das Material an den Rändern durchlaufen den Boden des Behälters zu lösen. Wenn der Zylinder von Sand oder Erde, enthält das Werk frei auf dem Papier ist, teilen Sie es in der Mitte, die Pflanzenwurzel zu offenbaren. Falls gewünscht, nehmen Sie Proben des Sandes von nahe dem Rand des Containers sowie in der Nähe der Wurzel. Dies kann nützlich zur Bestimmung der Ausbreitung (und Ansammlung und Wachstum) der Bakterien sein. Messen Sie die Länge der Wurzel. Abholen der Wurzelverzeichnis und entfernen Sie den Sand und Bakterien locker an die Wurzel (die Rhizosphäre Material) durch Eintauchen der Wurzel in einem gemessenen Volumen von Wasser oder Puffer und vorsichtig schütteln. Bestimmen Sie die tragfähige Zellzahl der Bakterien in die entstandene Suspension durch Ausplattieren auf einem geeigneten Datenträger wie Luria Agar. Dies entspricht der Anzahl der Bakterien, die locker mit der Wurzel verbunden. Entfernen Sie die eng gebundenen Bakterien durch Ultraschallbehandlung und bestimmen Sie ihre Zahl zu, wie unter Punkt 7.1 beschrieben. Alternativ, um zu bestimmen die Lage an der Wurzel des eng gebundenen Bakterien platzieren die gewaschene Wurzel auf der Oberfläche einer Petrischale mit Nähragar oder einem anderen geeigneten Medium. Beobachten Sie den Standort von Bakterienkolonien auf die Wurzel in den nächsten 3 Tagen mit einem sezierenden Mikroskop oder Lupe. Express-Ergebnisse als Anzahl der Bakterien pro Pflanze, pro cm2 Fläche, pro cm Wurzellänge oder pro Gramm Frischgewicht des Gewebes. Mehrere Wiederholungen am selben Tag zu tun und auch Wiederholungen an verschiedenen Tagen mit verschiedenen Bakterienkulturen und verschiedenen viel Pflanzenmaterial. (8) festzustellen, ob ein Effekt der Inkubationsbedingungen auf Haftung wegen einer Antwort die Bakterien oder die Anlage Verwenden Sie tot oder Toten Pflanzenmaterial. Unterziehen Sie die Pflanze Material für eine Vielzahl von Chemikalien, Fixiermittel oder andere Behandlungen wie Hitze um es zu töten. Waschen Sie das Pflanzenmaterial in Wasser und Inkubation Medium nach der Verwendung dieser Behandlungen. Dann die Bakterien zu impfen. Dies wird nicht der Pflanzenoberfläche zerstören, aber das würde es metabolisch inaktiv machen, so dass es nicht auf die Bakterien reagieren kann. Bakterielle Adhäsion zu messen, wie in den Schritten 6 und 7 beschrieben. Außerdem bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen hinzugefügt, um die Inkubation mit Pflanzenmaterial zu Beginn der Inkubation und die Anzahl der lebensfähigen Zellen am Ende der Inkubation um sicherzustellen, dass keine giftigen Chemikalien anwesend während der Inkubation waren vorhanden. Verwenden Sie lebloses Material. Verwendung bakteriellen Einhaltung lebloses Material zu ermitteln, ob ein Effekt gesehen auf bakterielle festhalten, Material zu Pflanzen ist aufgrund der Auswirkungen auf die Anlage oder die Bakterien. Wählen Sie ein leblose Material an die Bakterien binden und ähnelt in Form und Größe auf das Pflanzenmaterial studierte. Die Möglichkeiten umfassen Filterpapiere aller Arten (Zellulose, Nitrozellulose, Glasfaser, Polycarbonat, etc.), Threads (Nylon, Baumwolle, Polyester, Glaswolle, etc.), Glas oder Kunststoff Deckgläsern, Edelstahl-Gutscheine und Dialyse Membranen. Waschen Sie die leblose Material gründlich mit Wasser und das Medium, in dem die Inkubation durchgeführt werden und vor Gebrauch sterilisieren. Die meisten in Schritt 8.2.1 aufgeführten Materialien sind stabil, Sterilisation durch Autoklavieren. Inkubieren Sie die leblose Material unter den gewünschten Bedingungen und Gäste wie in den Schritten 6 und 7 beschrieben. Ein Beispiel für die Verwendung von Nylonfäden zu bestimmen, dass die reduzierte Bindung von A. Tumefaciens an Wurzelhaare bei hohen Kalzium-Konzentrationen zurückzuführen ist (zumindest teilweise) zu einer Wirkung von Kalzium auf die Bakterien ist in Abbildung 4-28dargestellt.