Hechting van bacteriën te planten oppervlakken gemeten in het laboratorium

1. bereiding van een plantmateriaal Bereiden zaailingen gegroeid in water. Plaats een klein aantal zaden (minder dan 30) in een 30, 50, 100 of 150 mL glas bekerglas. Met dit protocol hebben we tomaat, alfalfa, Arabidopsis thaliana, erwt, Boon, tabak, sla en wortel zaden gebruikt.Opmerking: Om te bepalen hoeveel zaden kunnen samen worden gesteriliseerd zonder besmetting zich verbreidt vanuit een zaad naar de andere, zie stap 1.1.2. Bedek de zaden met 80% ethanol en kort wervelen. Laat de zaden weken voor 1 min. Giet af de ethanol en bedek de zaden met een oplossing van 50% van het volume commerciële bleekmiddel (NaClO) en 0,1% Triton X-100 in leidingwater. Laat de zaden weken voor 20 min.Opmerking: Als de zaden groot, zoals bonen, zaden zijn, het kan noodzakelijk zijn om te verlengen van de inweken tijd om volledig het doden van schimmels op het oppervlak van het zaad. Giet af het mengsel van bleekmiddel en de zaden 3 keer met steriel water wassen. Laat de zaden genieten in het water voor 1 min voor elke wassen. Om op te halen Voeg een zaailingen een kleine hoeveelheid steriel water tussen 5 en 25 mL afhankelijk van de grootte van de zaden. Giet de zaden en water in een steriele petrischaal voor de kieming van het zaad.Opmerking: Het water moet betrekking hebben op de onderkant van de schotel maar niet Bedek de zaden ter bevordering van de vorming van root haren. Een beschrijving van een cultuur waarin slechts een enkele soort organisme aanwezig is. Incubeer in het donker de zaailingen totdat de gewenste grootte tussen 1 cm en 10 cm (ongeveer 5 dagen voor tomaat en A. thaliana en 1 tot 3 dagen voor Luzerne). Gebruik een overdekte steriele container met een capaciteit van meer dan 100 mL zoals een glazen schotel bedekt met folie voor de grotere zaden. Bepaal de frequentie van de besmetting van een bepaalde partij met micro-organismen die levensvatbaarheid op of binnen de zaden na oppervlak-sterilisatie.Opmerking: Dit is nodig omdat occasionele zaden dragen micro-organismen onder de zaad-vacht die niet kan worden gedood door oppervlakte-sterilisatie. De frequentie van besmette zaden in veel zaad gebruiken om te bepalen hoeveel zaden te steriliseren tegelijk zonder een hoog risico van de groep van zaden steeds besmet als gevolg van een zaad met bacteriën of schimmels die de behandeling overleven. 1.1.1 via 1.1.3 stappen uitvoeren. Plaats de zaden op een nutriëntagar petrischaal. Zetten over 10-30 zaden in elke schotel afstand tussen hen uit zodat zij afzonderlijk kunnen worden gescoord. Het zegel van de gerechten met tape of verzegeling film. Incubeer gedurende 3-5 dagen bij 25 ° C elke dag voor zichtbare uitgroei van micro-organismen uit de zaden te scoren. Bereiden zaailingen gegroeid in zand. Zaailingen kunnen worden geteeld in zand voor gebruik in bacteriële hechting proeven. 1.1.1 via 1.1.3 stappen uitvoeren. Kwarts of zee zand in de autoclaaf steriliseren. Beide bevatten sommige organisch materiaal. Als dit zal invloed hebben op het experiment, was het zand door bedekken met tweemaal haar volume van 0,1 M HCl. Mix voor 10 min. toestaan het zand om te regelen en giet af de vloeistof. Spoel het zand 3 keer met water, en een keer met 80% ethanol gevolgd door twee extra water gespoeld met behulp van hetzelfde protocol wat betreft de 0,1 M HCl. Sterilize het gewassen zand in de autoclaaf. Steriliseren containers door dompelen hen in 50% bleekwater gedurende 5 minuten en spoel ze 5 keer met steriel water door onderdompeling. Laten drogen en verzegel de bodem met het afdichten van de film. De film zoals verkregen van de fabrikant is over het algemeen vrij van micro-organismen aan de binnenkant zijde die tegenover de binnenkant van de container moet worden geplaatst. Meng het steriel zand met genoeg steriel water te bevochtigen het genoeg dat het zand stokken. Het bedrag zal afhangen van hoe droog het zand is. 10-35% van het volume van het zand is meestal voldoende. Plaats het natte zand in de container waardoor voldoende diepte voor de lengte van de wortels nodig en voldoende ruimte boven het zand voor de groei van de shoot. De exacte afstand is afhankelijk van de soorten en de variatie van de plant wordt gebruikt. Plant de zaden. Maak een ondiepe gat in het zand met een steriel glasstaafje gewoon diep genoeg om te plaatsen het zaad onder het oppervlak van het zand (ongeveer 1-5 mm). Plaats het zaad in het gat. Bedek het met een dun laagje zand. Het zegel van de bovenkant van de container met het afdichten van de film om te voorkomen dat het verlies van water en ingang van extra microben. Groeien de planten in het laboratorium onder een licht of in de serre op een passende temperatuur en dag-lengte voor de soorten en de verscheidenheid van de plant. Voor tomaten, alfalfa of Arabidopsis thaliana gebruik kamertemperatuur en 12 h licht/donker cyclus. Plant de zaailingen in een gat in het zand (1-2 mm in diameter en diep genoeg dat de wortel zal worden bedekt met zand). Maak het gat met een steriel glasstaafje. De wortel zorgvuldig begeleiden in het gat met behulp van een steriele roestvrij stalen haaknaald nodig als de zijkanten van het gat vullen met zand. U kunt ook planten axenically te groeien op of in agar met een mengsel van zouten, zoals zouten van MS. Gebruik schiet van een planten direct geteeld in agar. Vermijd wortels gegroeid met agar zoals agar houdt zich aan het oppervlak van de plant én de bacteriën. Dit kan resulteren in een valse indruk van bacteriële hechting aan het oppervlak van de plant. 2. voorbereiding van andere plantaardige materiaal Wassen plantmateriaal gegroeid in de serre met water vóór gebruik te verminderen van het aantal inheemse microben. Er zullen bacteriën en schimmels op de planten. Protozoa zal in de bodem, de wortels, en mogelijk de bladeren aanwezig zijn. Wassen met bleekmiddel of ethanol doet afbreuk aan het oppervlak van de plant en wordt niet aanbevolen. Als na het water wassen aanzienlijke aantallen van microben blijven, behandelen de planten met verdunde vloeibare hand zeep of verdunde waterstofperoxide (0.01%) te verwijderen of doden microben. Dit is over het algemeen minder schadelijk is voor de plant dan bleekmiddel of ethanol. Als plant is materiaal gekocht bij een lokale markt moeilijk te ontsmetten, kies materiaal dat niet lijkt te lange opslag hebben ondergaan. Vermijd het delen van het materiaal die bruin of beschadigd voorkomen. Wassen met water en verse bezuinigen op de uiteinden van materiaal dat eerder verlaagd alvorens het te gebruiken, tenzij de interacties van de bacteriën van de test met de bacteriën (en eukaryoten) die zal hebben verzameld op gesneden sites van belang zijn. Niet wassen met bleekwater of ethanol als ze doet afbreuk aan het oppervlak van de plant. Behandel de wond sites. Wond-sites bieden bacteriën vaak toegang tot het interieur van het plant materiaal18. Blokkeren of verminderen van de bacteriële gehechtheid aan, en het verkeer via, wond of gesneden sites die zijn gemaakt bij de voorbereiding van het materiaal door dompelen de gesneden rand in gesmolten paraffine of door het schilderen van de site met gesmolten paraffine met een kleine borstel. Gebruik geen een spatel of een scherpe implementeren als dit schade aan het weefsel veroorzaken kan. Zegel stammen littekens op groenten zoals tomaten met paraffine. Sommige bacteriën zal zwemmen in het gebied onder de paraffine, maar hun nummers zijn over het algemeen klein. Als bacteriële indienststelling wond sites van belang, raming de afstand die bacteriën zich kunnen verplaatsen die water streams of diffusie is door het observeren van het verkeer van een kleurstof toegevoegd aan de oplossing. Mark motile bacteriën door de invoering van een gen een fluorescente proteïne zoals groen fluorescente proteïne (GFP) codering in hen en ze traceren met behulp van fluorescentie microscopie in stap 6.1.219beschreven. 3. voorbereiding van de bacteriën De bacteriën groeien. Gebruik een medium dat dichtst de voorwaarden de bacteriën benadert zijn waarschijnlijk onmiddellijk voorafgaand aan de ontmoeting van de plant in de echte wereld buiten het laboratorium zijn blootgesteld aan. Koolstof en stikstof bronnen alsmede de aanwezigheid van ionen, met name divalente kationen (Ca, Mg, Fe, Mn en Zn) en fosfaat en de pH van het medium zijn belangrijk. Gebruik minimaal AB medium of Luria bouillon voor A. tumefaciens en andere bodem bacteriën20. Gebruik voor E. coli, die kunnen ontstaan in de darm, Luria Bouillon. Inductoren zoals wortel exsudaat of commerciële plantenextracten zoals soytone of suikers zoals sucrose of xylose toevoegen aan de middellange21. Als deze stoffen worden gebruikt als inductoren, voegt u een lage concentratie, bijvoorbeeld 0,01%. Als ze gebruikte koolstof bronnen, voeg een hogere concentratie, bijvoorbeeld 0,1%. De bacteriële entmateriaal voor te bereiden. Verdun de bacteriën in steriel water of in het medium waarin de incubatie wordt uitgevoerd en voeg ze toe aan het plantmateriaal. De aangewezen verdunning wordt besproken in stappen 4.2 en 4.3. Als u wilt verwijderen de groei media voordat u de bacteriën, centrifugeren van de bacteriële schorsing bij 10.000 x g gedurende 2 min, giet af het supernatant en resuspendeer de bacteriën door vortexing hen in hetzelfde medium die zal worden gebruikt voor de incubatie met het plantmateriaal. Deze methode kan verwijderen of verlagen van het aantal of de hoeveelheid extracellulaire materiaal en huiduitwassen zoals exopolysaccharides, capsules, flagellae en/of pili. Als het is belangrijk dat deze oppervlakte structuren intact blijven, dan gewoon de bacteriën verdund voordat ze enten of gebruik de alternatieve methode beschreven in stap 3.2.2. Als een alternatieve methode om te verwijderen groeimedium, de bacteriën op een nitrocellulose of polycarbonaat filter met een poriegrootte van 0,2 µm of minder te verzamelen. Wassen van de bacterie met het medium van de incubatie en resuspendeer hen door zacht schudden of vortexing van het filter in een steriele container van het medium. 4. de inoculatie van de bacteriën Bepaal het aantal bacteriën worden geïnoculeerd met betrekking tot de metingen die moeten worden gebruikt om te bepalen van bacteriële hechting en de duur van de incubatietijd. Inoculeer relatief grote aantallen bacteriën voor microscopische studies waarbij incubatie keer minder dan 1 dag. Voeg een hoeveelheid cultuur te bereiken een bacteriële eindconcentratie van meer dan 106 bacteriën per mL. Voor langere incubatietijd kleiner keer bacteriële entmateriaal. Studies waarin bacteriële hechting zal worden afgemeten aan levensvatbare cellen telt, voeg een hoeveelheid cultuur te bereiken een bacteriële eindconcentratie van 103 tot en met 106 bacteriën per mL. Vermijd het toevoegen van zoveel bacteriën dat hun metabolisme de pH of zuurstof concentratie in het incubatie-medium verandert. Meten van pH met pH-papier of een elektrode. Het zuurstofgehalte van de maatregel met een zuurstof-elektrode. Inoculeer voor planten gekweekt in zand, in drie mogelijke manieren. Het enten van het zaad met de bacteriën voor het planten van het zaad voor 1 min. onderdompelen in een suspensie in water van ongeveer 106 bacteriën per mL. Beënt de wortel door een zaailingen kiemen zoals beschreven in sectie 1 en wanneer de zaailing wortel is ongeveer 1 cm lang dompelen het of het plaatsen van de hele zaailing in een suspensie van 106 bacteriën per mL in water voor 1 min. Inoculeer zand door de bacteriën te vermengen met het zand voor het planten om een eindconcentratie van ongeveer 103 bacteriën per mL of door de zaailing met een suspensie van 106 bacteriën per mL water na het planten. 5. de incubatie van de bacterie met het plantmateriaal Voor incubatie in vloeibare media, Incubeer de bacteriën met het plantmateriaal in steriel water of sucrose en minerale zouten of plantaardige weefsels kweekmedium (zoals een 1:10 verdunning van MS zouten)22,23. Gebruik een container waarnaar de bacteriën niet aanhangen. Proberen te houden van het oppervlak van de plant bedekt continu door onderdompeling of zachte agitatie. Krachtige agitatie kan voorkomen hechting of zelfs verwijderen bacteriën uit het oppervlak van de plant. Observeer het plantmateriaal in de lichte Microscoop na verschillende tijdsintervallen om te bepalen wanneer om te stoppen met de incubatie en metingen. Een tijdsverloop van adhesie is vaak waardevolle met monsters van elke 1 tot en met 4 h of elke dag afhankelijk van de snelheid van de interactie. Om te broeden in zand, gelden dezelfde overwegingen voor incubatie in vloeistof in stap 5.1 beschreven. 6. meting van de hechting met behulp van microscopie Microscopische metingen met Nomarski of fase-contrast optiek voor het gemakkelijke bekijken van de bacteriën op oppervlakken maken Elke lichte-veld microscoop met vergroting van 20 X of hoger kan echter worden gebruikt. Microscopische observatie gebruiken om te bepalen als de bacteriën zijn willekeurig verdeeld of in specifieke sites. Ook controleren of ze afzonderlijk of in clusters gebonden zijn. Kijk voor de aanwezigheid van microcolonies suggereren bacteriële groei of beklemming na hechting. Controleer of de bacteriën lijken te vormen van een biofilm op het oppervlak.Opmerking: Een biofilm is een groot aantal bacteriën gebonden aan het oppervlak en is omgeven door een extracellulaire matrix23,24,25. De structuur kan worden glad en uniform of een meer gecompliceerde architectuur hebben. Methoden voor het bestuderen van biofilms gekoppeld plant oppervlakken zijn beschreven17. Gebruik van bacteriën die zijn gelabeld met een fluorescerende marker. Als andere bacteriën aanwezig zijn, maar de bacteriën van belang worden geïdentificeerd door een fluorescerende tag zoals groen fluorescent proteïne, gebruikt u de fluorescentie microscopie om te bepalen van de aanwezigheid van de tagged bacteriën in clusters van andere bacteriën26. Voor GFP, door een filter te gebruiken met 490 nm excitatie en 520 nm emissie. Controleer dat de fluorescerende tag is niet negatief van invloed op de bacteriën door het observeren van de hechting tot een materiaal met een gelijke mix van wild type bacteriën en tagged bacteriën van dezelfde stam met behulp van zowel de Nomarski als de fluorescentie optica. Als de fluorescerende en donkere bacteriën willekeurig gemengd en in gelijke aantallen aanwezig zijn dan de tag niet bemoeien met de test. Bepaal het aantal bijgevoegde bacteriën.Opmerking: Het is erg moeilijk om te bepalen van het aantal bijgevoegde bacteriën in de Microscoop. Als de binding op onregelmatige plant oppervlakken is, is het over het algemeen niet mogelijk om een kwantitatieve meting. Scanning elektronen microscopie (die niet in dit artikel wordt besproken) kan worden gebruikt om dergelijke metingen. Wanneer de bacteriën zijn gebonden aan een glad oppervlak zoals een haar van de wortel, tellen het aantal bacteriën gebonden aan de rand van het haar van de wortel per mm root haarlengte. Zorg voor het gebruik van root haren van ongeveer dezelfde grootte en vorm in het vergelijken van metingen. Om te bepalen van de grootte van objecten in de Microscoop, gebruikt u een commerciële dia met gemeten merktekens daarop. Observeren en fotograferen van deze dia op de dezelfde instellingen gebruikt voor de experimentele materiaal en de resulterende afbeeldingen gebruiken om te bepalen van de grootte van objecten in de photomicrographs. Het monster voorbereiden microscopie. Het wassen van het monster. Verplaatsen van het monster tot een daling van water of incubatie medium op een microscoopglaasje en het direct waarnemen.Opmerking: Dit heeft het voordeel dat als er geen bacteriële groei of werkelijke bacteriële dood er zijn waarschijnlijk niet veel gratis bacteriën. Neem de afwezigheid van vrije bacteriën als een waarschuwing dat er weliswaar bacteriële dood of bacteriële binding aan de container waarin de incubatie werd uitgevoerd. Het effect van het wassen van het monster is afgebeeld in Figuur 1. Wassen het monster zachtjes in water of incubatie medium door te plaatsen het in een flesje van vloeistof en de ampul voorzichtig omkeren. Plaats dan het monster op het microscoopglaasje in verse vloeistof voor observatie. Monteer het monster in vloeistof met behulp van een gewone cover slip en microscoopglaasje. Als het monster dik is en dus zou een verdikking onder de cover slip, gebruikt u een press-apply cover slip. Deze cover slips hebben een ring van rubber of plastic rond de rand van de slip van de cover. Plaats de vloeistof en het monster in de put in de cover slip en vervolgens de dia plaats op bovenkant en druk naar beneden voorzichtig te verzegelen de slip van de cover aan de dia. Omkeren en onderzoeken. Ook gebruiken een algen tellen dia en cover slip op een vergelijkbare manier. Merk op dat de dia’s met deze diepte in het algemeen met een objectief van meer dan 20 X vergroting kunnen niet worden onderzocht. Figuur 1 : Stappen in de voorbereiding van een monster voor de bepaling van het aantal afhankelijke bacteriën. A. tumefaciens bindende tomaat wortel haren (A, B en C) en nylon draden (D, E en F). In monsters gemonteerd in water zonder wassen zowel bacteriën (zwarte pijlen gebonden) en gratis bacteriën (witte pijlen) kunnen worden gezien (A en D). Na het wassen de afhankelijke bacteriën blijven maar de vrije bacteriën zijn geen langer aanwezig (B en E). Na ultrasoonapparaat zijn de afhankelijke bacteriën verwijderd van het oppervlak van de steekproef (C en F). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Als tl bacteriën werden gebruikt, controleert u het monster in de Microscoop nadat het zand is verwijderd. Wortels van planten gekweekt in zand zijn over het algemeen niet geschikt voor microscopie als de deeltjes zand met de waarneming van de bacteriën interfereren. Het verwijderen van de plant uit een container van de groei vanaf stap 7. Plaats de wortels in een container van het water en zachtjes mix om te verwijderen het zand die naar de onderkant van de container regelen zal. Verwijderen van de plant uit het waswater en mount het monster zoals in stap 6.3.3. 7. meting van de hechting met behulp van levensvatbare cellen telt Bepaal het aantal levensvatbare bijgevoegde bacteriën met behulp van een ultrasoonapparaat. Verwijder de niet-afhankelijke bacteriën. Leg het monster in een flesje met voldoende water, buffer of incubatie medium om te dekken van het plantmateriaal en omkeren van de flacon meerdere malen wassen. Als er meer dan 103 gratis bacteriën per mL aanwezig zijn in de eerste incubatie, uitvoeren sequentieel spoelingen om alle van hen te verwijderen. Controleer in een lichte Microscoop (zie stap 6.3) om te bepalen van de aanwezigheid van vrije bacteriën. Wassen totdat er een aanzienlijke vermindering van het aantal vrije bacteriën maar vergeet niet dat er een evenwicht tussen afhankelijke en niet-afhankelijke bacteriën dus het aantal gratis bacteriën nooit tot nul dalen kan. Verwijder het monster uit het flesje vloeistof met een pincet of spatel te wassen. Bepaal het aantal afhankelijke bacteriën in incubations van planten in vloeistof. Opschorten van de gewassen monster in een flesje en bedek het met een afgemeten hoeveelheid water, of incubatie medium wassen buffer. Gebruik voldoende vloeistof ter dekking van het monster. Plaats de ampul in een bad ultrasoonapparaat en bewerk het ultrasone trillingen ten voor één min. Verwijder het monster en onderzoeken onder de lichte Microscoop om te bepalen of de afhankelijke bacteriën zijn verwijderd uit de plant. De verwijdering van de bacteriën uit een monster met het ultrasoonapparaat is afgebeeld in Figuur 1. Als er nog steeds gebonden bacteriën aanwezig blijven sonicating van het monster tot een tijdstip dat geen afhankelijke bacteriën op het oppervlak van de steekproef blijven. Als de afhankelijke bacteriën niet kunnen worden verwijderd met het ultrasoonapparaat, 1-10 mg/mL steriele kwartszand toevoegen en herhaal het ultrasoonapparaat en microscopisch onderzoek. Bepalen dat de procedure ultrasoonapparaat die lijkt het meest effectieve in stap 7.1.3.2 niet de levensvatbaarheid van de bacteriën vermindert door schorsing van de bacteriën uit een vloeibare cultuur in de oplossing moeten worden gebruikt voor ultrasoonapparaat (toevoegen kwartszand, als het nodig was). Het aantal levensvatbare cellen te bepalen. Bewerk de bacteriën ultrasone trillingen ten en het aantal levensvatbare cellen opnieuw bepalen.Opmerking: Als er een afname van het aantal levensvatbare cellen, wijzigen de procedure door de samenstelling van de vloeistof en/of ultrasoonapparaat tijd totdat de behandeling geen invloed op het aantal levensvatbare cellen heeft te wijzigen. Bepalen dat de buffer van de verdunning gebruikt voor levensvatbare cellen niet aan de levensvatbaarheid van bacteriën die onder de voorwaarden afdoet door het vergelijken van levensvatbare cellen graven gemaakt met behulp van verschillende verdunning buffers en/of water gebruikt hebben zijn geïncubeerd. Bepaal het aantal levensvatbare bijgevoegde bacteriën met behulp van homogenisering. Leg het monster in een steriele vijzel of blender of andere homogenisering apparaat. Bedek het met een gemeten volume steriel water, of incubatie medium buffer27wassen. Gebruik een volume voldoende ter dekking van het monster. Voor een blender gebruiken 100 mL. Het malen van het monster tot het goed is gehomogeniseerd. Controleer de pH nadat homogenisering om zeker te zijn dat zuur vrijgelaten uit het weefsel van de plant niet geleid een scherpe daling in pH van minder dan 7 tot heeft. Als de pH gedaald gebruiken een buffer zoals fosfaatbuffer in de homogenisering vloeistof om de pH. Het aantal levensvatbare cellen te bepalen. Gebruik bacteriën gemarkeerd met resistentie tegen antibiotica. In situaties waarin meer dan één soort bacterie aanwezig is, markeren bacteriestammen met behulp van spontane resistentie tegen antibiotica (meestal rifampicine en nalidixic zuur). Bepaal het niveau van antibiotica te gebruiken. Als culturen van andere organismen moet aanwezig zijn in de incubatie verwacht beschikbaar zijn, plaat deze culturen gegroeid onder de voorwaarden van de beoogde incubatie met planten op platen met een aantal uiteenlopende concentraties van het gekozen antibiotica. Bepaal de laagste concentratie die geen groei van om het even welk van deze organismen staat. Dit is de laagste concentratie van een antibioticum waarnaar de bacteriën van de test moeten worden resistent. Spontane antibiotica resistente mutanten te verkrijgen. Groeien een cultuur van de bacteriën in rijke middellange tot eind logboek of stationaire fase. Plaat 0,1 mL onverdund op een bord met de gewenste antibioticum met een geschikte concentratie. Het bepalen van de concentraties te gebruiken zoals beschreven in stap 7.3.1.1. Houden en te zuiveren van de bacteriën die groeien en dus resistent zijn tegen het antibioticum. Bepalen dat resistentie tegen antibiotica niet de groei van de bacteriën vermindert door het doen van een groeicurve in de vloeistof van de ouder en het antibioticum resistente stammen. Bepalen dat de antibiotica resistente bacteriën hetzelfde niveau van kolonisatie van een plantaardig materiaal als de ouderstam, tonen als dit mogelijk is. Bepaal het aantal levensvatbare bacteriën gebonden aan planten gekweekt in zand. Het verwijderen van de plant uit de container en zand. Als u planten uit containers, wilt verwijderen eerst afdichting materiaal op de boven- en onderkant van de container. Plaats de container over een stuk steriel papier en zachtjes Verwijder de hele zand of bodem en plant als één grote taps toelopende cilinder zachtjes kloppen de container tegen een oppervlak het materiaal los te maken. Gebruik indien nodig een spatel of staaf los van het materiaal rond de randen doorlopen de onderkant van de container. Als de cilinder van zand of grond met de plant vrij op het papier is, kunt u het gesplitst in het midden te openbaren de wortel van de plant. Indien gewenst, monsters van de zand uit in de buurt van de rand van de container, maar ook in de buurt van de wortel nemen. Dit kan zinvol zijn om de verspreiding en accumulatie en groei van de bacteriën. Meet de lengte van de wortel. Ophalen van de hoofdmap en verwijder de zand en bacteriën vasthouden losjes aan de wortel (de rhizosfeer materiaal) door dompelen de wortel in een afgemeten hoeveelheid water of buffer en het zachtjes te schudden. Bepaal het aantal levensvatbare cellen van de bacteriën in de resulterende suspensie door plating op een geschikt medium zoals Luria agar. Hiermee wordt het aantal bacteriën losjes gekoppeld aan de hoofdmap. Verwijder de strak gebonden bacteriën met het ultrasoonapparaat en bepalen hun nummers, zoals beschreven in stap 7.1. Als alternatief, als u wilt bepalen de locatie in de hoofdmap van de strak gebonden bacteriën plaats de gewassen wortel op het oppervlak van een petrischaal met nutriëntagar of een ander geschikt medium. De locatie van bacteriële kolonies in de hoofdmap observeren in de komende 3 dagen met behulp van een Microscoop ontleden of vergrootglas. Expliciete resultaten als aantal bacteriën per plant, per cm,2 van oppervlakte, per cm wortel lengte of per gram verse gewicht van weefsel. Meerdere wordt gerepliceerd op dezelfde dag en ook doen wordt gerepliceerd op verschillende dagen met verschillende bacteriële culturen en percelen van plantaardig materiaal. 8. om te bepalen of een effect van incubatieomstandigheden op hechting als gevolg van een reactie van de bacteriën of de plant Het gebruik van dode of gedode plantmateriaal. Onder voorbehoud van de plant materiaal aan een verscheidenheid van chemicaliën, fixatives of andere behandelingen zoals warmte om te doden. Het plantmateriaal grondig wassen in water en incubatie medium na het gebruik van om het even welk van deze behandelingen. De bacteriën dan worden geënt. Dit zal niet het vernietigen van het oppervlak van de plant, maar het zal het metabolisch inactief maken zodat het niet kan op de bacteriën reageren. Meten bacteriële wrijvingscoëfficiënt zoals beschreven in stappen 6 en/of 7. Ook bepalen het aantal levensvatbare cellen toegevoegd aan de incubatie met de plantmateriaal aan het begin van de incubatie en het aantal levensvatbare cellen aanwezig aan het eind van de incubatie om ervoor te zorgen dat geen giftige chemicaliën aanwezig tijdens de incubatie waren. Gebruik levenloos materiaal. Gebruik bacteriële aanhankelijkheid aan levenloze materiaal om te bepalen of een effect gezien op de naleving van de bacteriële plantmateriaal is te wijten aan een effect op de plant of de bacteriën. Kies een levenloos materiaal waarnaar de bacteriën binden en die is in vorm en grootte vergelijkbaar met het plantmateriaal studeerde. De mogelijkheden omvatten filtreerpapier van alle typen (cellulose, nitrocellulose, glasvezel, polycarbonaat, enz.), draden (nylon, katoen, polyester, glaswol, enz.), glas of plastic coverslips, RVS coupons en dialyse membranen. Het levenloos materiaal grondig in water en het medium waarin de incubatie wordt uitgevoerd en het steriliseren vóór gebruik te wassen. De meeste van de in stap 8.2.1 genoemde materialen zijn stabiel tot sterilisatie in autoclaaf. Incubeer de levenloos materiaal onder de gewenste voorwaarden en de score zoals beschreven in stap 6 en 7. Een voorbeeld van het gebruik van nylon draden om te bepalen dat de verminderde afhankelijkheid van A. tumefaciens aan root haren bij hoge calcium concentraties verschuldigd is (ten minste gedeeltelijk) naar een effect van calcium op de bacteriën wordt weergegeven in Figuur 428.