Одновременное отображение и количественный Ribonucleotides в митохондриальной ДНК человека
Summary
Здесь мы описываем метод поддаются одновременно quantitate и карты генома всей ribonucleotides в высоко нетронутыми ДНК в резолюции единого нуклеотидом, сочетая ферментативного расщепления геномной ДНК с щелочной гидролиз и последующего 5´ конец последовательности.
Abstract
Установленные подходы к оценить количество ribonucleotides в геноме ограничиваются количественный включены ribonucleotides с использованием коротких синтетических фрагментов ДНК или плазмиды как шаблоны и затем экстраполировать результаты в целом геном. Кроме того количество ribonucleotides в геном может быть определена с помощью щелочной гели или Южные помарки. Более недавние подходы в естественных условиях используют следующего поколения виртуализации, позволяя Картирование генома широкий ribonucleotides, обеспечивая положение и личность встроенных ribonucleotides. Однако они не позволяют количественный количество ribonucleotides, которые включены в геноме. Здесь мы опишем, как одновременно карта и quantitate количество ribonucleotides, которые включены в человека митохондриальной ДНК в естественных условиях путем sequencing следующего поколения. Мы используем очень нетронутыми ДНК и ввести последовательность конкретных двойной нити перерывы, переваривание с эндонуклеазы, впоследствии гидроизолирующей включены ribonucleotides щелочью. Сгенерированный концы лигируют с адаптерами и эти концы виртуализируются на компьютере виртуализации нового поколения. Абсолютное количество ribonucleotides может быть рассчитана как количество операций чтения за пределами сайта признание за среднее количество операций чтения на сайте признание для конкретных эндонуклеазы последовательности. Этот протокол может также использоваться для сопоставления и quantitate бесплатные Никс в ДНК и позволяет адаптации для сопоставления других повреждений ДНК, которые могут быть обработаны 5´-OH концы или 5´ фосфат заканчивается. Кроме того этот метод может применяться к любой организм, учитывая, что подходящую ссылку генома доступен. Таким образом, этот протокол обеспечивает важным инструментом для изучения репликации ДНК, 5´ конец обработки, повреждение ДНК и репарации ДНК.
Introduction
В эукариотической клетке концентрация ribonucleotides (rNTPs) намного выше, чем концентрация deoxyribonucleotides (дНТФ)1. Полимераз дискриминировать ribonucleotides, но эта дискриминация не является совершенным, и, как следствие, ribonucleotides вместо deoxyribonucleotides могут быть включены в геномах во время репликации ДНК. Ribonucleotides может быть наиболее распространенных неканонических нуклеотидов, включены в геноме2. Большинство из этих ribonucleotides удаляются во время созревания фрагмент Окадзаки РНКазы H2 начатый рибонуклеотид иссечение ремонт (RER) или топоизомеразы 1 (обзор в ссылку3). Ribonucleotides, которые не могут быть удалены остаются стабильно включены в ДНК2,4 и может повлиять на его вредных и полезных способов (обзор обзор5). Помимо возможности действовать в качестве позитивных сигналов, например в спаривания тип переключения в делящиеся pombe6 и маркировки зарождающейся стренге дна во время несоответствие ремонт (MMR)7,8, ribonucleotides влияет на Структура9 и стабильность окружающих ДНК из-за 2´ гидроксильные группы их рибозы10привело репликативной стресс и геном нестабильность11. Обилие ribonucleotides в геномной ДНК (геномная ДНК) и их актуальности в репликации и ремонту механизмов, а также последствия для стабильности генома, дают основания для расследования их точное вхождение и частоты в геном всей манере.
РНКазы H2 деятельности не были найдены в человека митохондрии и ribonucleotides, поэтому не эффективно удаляются в митохондриальной ДНК (мтДНК). Несколько путей участвуют в поставках нуклеотидов в человека митохондрий и расследовать ли беспорядков в бассейне митохондриальной нуклеотидов вызывают повышенное количество ribonucleotides в митохондриальной ДНК человека, мы разработали протокол к карте и quantitate Эти ribonucleotides в человека мтДНК, изолированных от фибробласты, клетки HeLa и пациента клеток линии12.
Большинство в vitro подходы (обзор обзор13) для определения ДНК полимеразы избирательности против rNTPs основаны на одной рибонуклеотид вставки или праймер расширение экспериментов, где конкурирующие rNTPs включаются в реакции микс, позволяя идентификации или относительное количественный рибонуклеотид инкорпорации в нескольких шаблонах ДНК. Количественные подходы на коротких последовательностей могут не отражать dNTP и rNTP бассейны в концентрациях, сотовой и поэтому обеспечивают понимание полимеразы избирательности, не ограниченное значение относительно всей геномов. Было показано, что относительное количество ribonucleotides, включены во время репликации шаблон больше ДНК, например плазмида, могут быть визуализированы на геле виртуализации с помощью radiolabeled дНТФ и гидроизолирующей ДНК в щелочной среде14. Кроме того был проведен анализ геномная ДНК на Южные помарки после щелочной гидролиз, позволяя стренги зондирующего и определение абсолютного ставок рибонуклеотид инкорпорации в vivo15. Эти подходы позволяют относительное сравнение частоты включения, но доставить не понимание позиции или личность включены ribonucleotides. Более недавние подходы для анализа содержимого рибонуклеотид геномная ДНК в естественных условиях, как Хайден-Seq16, рибозы-Seq17, пу-Seq18или19emRiboSeq, воспользоваться преимуществами встроенного ribonucleotides чувствительность к щелочной или H2 РНКазы лечение, соответственно и использовать секвенирование нового поколения для выявления ribonucleotides генома общесистемной. Эти методы не обеспечивают понимание абсолютного включение частота обнаруженных ribonucleotides. Путем добавления шаг последовательности конкретных ферментативного расщепления Хайден seq протокол, метод, мы описали здесь удобно расширяет информацию, полученную от последовательности подхода, что позволяет одновременное отображение и количественный встроенных ribonucleotides12. Этот метод применим к практически любой организм, учитывая, что высоко нетронутыми ДНК экстракты могут быть созданы и подходящую ссылку генома доступен. Метод может быть адаптирована к quantitate и определить местонахождение любого поражение, которое может быть усваивается нуклеиназы и оставляет 5´ фосфат или 5´-OH-конец.
Карта и quantitate ribonucleotides в геномной ДНК, метод сочетает расщепления по последовательности конкретных эндонуклеазы и щелочной гидролиз генерации 5´ фосфат заканчивается на участках, где находится конкретное признание последовательности для эндонуклеазы и 5´- OH заканчивается в позиции, где находились ribonucleotides. Так как создаваемый свободные концы впоследствии лигируют с адаптерами и виртуализации с помощью виртуализации нового поколения, это важно использовать весьма нетронутыми ДНК и избежать случайных фрагментации во время подготовки ДНК добычи и библиотека. Оценки этих чтений, нормированный читает на участках расщепления эндонуклеазы позволяет одновременное количественный и сопоставление обнаруженных ribonucleotides. Бесплатные 5´ концы обнаруживаются в управления экспериментов, где щелочной гидролиз ДНК заменяется на лечение с KCl. Полученные данные дают представление о рибонуклеотид расположение и количество и позволяет анализ относительно содержания и включение частоты рибонуклеотид.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем технику одновременно карта и количественной оценки ribonucleotides в геномная ДНК и митохондриальной ДНК в частности, на простое введение расщепления ДНК на конкретных участках последовательности в геноме как дополнение к установленным Протоколом Хайден seq. Хотя это исследование фокусируется на митохондриальной ДНК человека, первоначально Хайден seq метод был разработан в Saccharomyces cerevisiae, иллюстрирующие этот метод перевода для других организмов12,16.
Надежные результаты, полученные от этого подхода, следует отметить некоторые важные шаги: (A) поскольку последовательности адаптеры перевязать все доступные 5´-концы, важно работать с высоко нетронутыми ДНК. ДНК, должен быть изолирован и библиотек следует предпочтительно сразу же после изоляции ДНК, или ДНК может храниться при температуре-20 ° C. Не рекомендуется хранить ДНК в холодильнике долгое время или неоднократно замораживать и размораживать его. (B) для создания подходящих библиотек с помощью этого метода, важно выполнять Кох лечения ДНК в духовке инкубации, вместо того чтобы Отопление блока, обеспечивая однородный нагрев всей выборки и количественных гидролиза. (C) Кроме того важно контролировать качество библиотек до объединения и последовательности. ДНК должны быть количественно и анализируются с помощью электрофореза автоматизированной системы для обеспечения достаточного количества библиотеки ДНК, подтвердить соответствующий фрагмент размеров и поискать Димеры праймера.
Для анализа значимых данных важно также отметить, что информационное значение этого метода зависит от надлежащего контроля для оценки графов фон и последовательности или прядь предубеждения. Мы регулярно достичь сопоставления эффективности в пробах KCl около 70%, когда только переваривание с конкретным эндонуклеазы последовательности (рис. 2B, левой панели). Кроме того, важно подтвердить, что лечение эндонуклеазы не затрагивает общего обнаружения включены ribonucleotides, сравнивая HincII лечить и лечить образцы (рисунок 3B). В этих экспериментах мы использовали HincII представить сайт конкретных сокращений, хотя другие высококачественные энзимы ограничения также могут быть использованы.
Протокол может быть адаптирована для изучения других типов повреждения ДНК, которые могут быть обработаны 5´ фосфат или 5´-OH заканчивается. Точность результатов зависит от специфики обработки и требует подходящие элементы управления (например, дикого типа или непереработанных) для проверки. Кроме того при адаптации этот метод для других приложений или для использования с другими организмами, следует учитывать, что метод в своей текущей установки требуется около 1 мкг ДНК, которая обрабатывается в библиотеку. Поскольку количество заканчивается зависит количество встроенных ribonucleotides, которая варьируется в зависимости от организма или мутант, образцы, включая меньшее количество ribonucleotides потребует более входных ДНК, чтобы создать достаточное количество заканчивается в Последующие библиотеки строительство. Аналогично Если образцы ДНК имеют гораздо большее количество ribonucleotides, она также потребует использования менее ввода ДНК для получения оптимальных условий для перевязки, второй стренги синтеза и амплификации PCR. Примечательно, что библиотека конструкции, описанный в настоящем Протоколе также созданных данных, охватывающих ядерного генома (как показано в Рисунок 2D) и только анализа данных было сосредоточено на митохондриальной ДНК. Это показывает, что этот метод также перехватываются больших геномов с умеренно низких частот рибонуклеотид.
При рассмотрении этого метода, следует учитывать определенные ограничения: Хотя этот метод в теории, следует применять к практически любой организм, подходящую ссылку генома необходима для выравнивания читает. Кроме того результаты, полученные от нашего протокола представляют считывает из большого числа клеток. Этот подход не могут быть определены конкретные рибонуклеотид Включение шаблонов подмножества ячеек. Если ribonucleotides сопоставляются в больших геномов, с очень низким количеством ribonucleotides, он может быть сложным различать ribonucleotides от случайных вмятин и поэтому необходимы соответствующие элементы управления.
Метод, мы описали здесь, расширяет имеющиеся в естественных условиях такие методы, как Хайден-Seq16, рибозы-Seq17, пу-Seq18или19emRiboSeq. Эти подходы воспользоваться встраиваемых ribonucleotides чувствительность к щелочной или H2 РНКазы лечение, соответственно, используя последовательность следующего поколения для выявления ribonucleotides всей генома, который позволяет их отображение и сравнение относительно включения. Раскалыванием последовательности ДНК, как описано выше, в дополнение к щелочной гидролиз на встраиваемых ribonucleotides, читает для ribonucleotides могут быть нормированы тех расщепления сайтов, позволяя не только выявление и картирование ribonucleotides, но также их количественный для каждой молекулы ДНК. Применение нашей техники в контексте заболеваний, относящиеся к репликации ДНК, репарации ДНК и TLS может обеспечить более глубокое понимание роли ribonucleotides в основные молекулярные механизмы и целостности генома в целом.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Шведский научно-исследовательский совет (www.vr.se) предоставляет дуги (2014-6466 и шведский фонд стратегических исследований (www.stratresearch.se) к ДУГЕ (ICA14-0060). Чалмерский технологический университет оказывает финансовую поддержку MKME в ходе этой работы. Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи.
Materials
| 10x T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0201S | |
| 10x T4 RNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0216L | |
| 1x PBS | Medicago | 09-9400-100 | dissolve 1 tablet in H2O to a final volume of 1 L |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 33539-1L-GL-R | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| 50 mL Centrifuge Tube | VWR | 525-0610 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP, 10 mM) | New England Biolabs | P0756S | dilute with EB to 2 mM |
| Agilent DNA 1000 Kit | Agilent Technologies | 5067-1504 | |
| BSA, Molecular Biology Grade (20 mg/mL) | New England Biolabs | B9000S | diltue with nuclease-free H2O to 1 mg/mL |
| Buffer EB | QIAGEN | 19086 | referred to as EB |
| CleanPCR paramagnetic beads | CleanNA | CPCR-0050 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix (10 mM each) | New England Biolabs | N0447L | dilute with EB to 2 mM |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61965026 | |
| DynaMag 96 Side | Thermo Fisher | 12331D | |
| Ethanol 99.5% analytical grade | Solveco | 1395 | dilute with milliQ water to 70% |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA, 0.5 M) | Sigma-Aldrich | 03690-100ML | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
| HEPES buffer pH 8.0 (1 M) sterile BC | AppliChem | A6906,0125 | |
| Hexammine cobalt(III) chloride (CoCl3(NH3)6) | Sigma-Aldrich | H7891-5G | dissolve in nuclease-free H2O for 10 M solution, sterile filter. CAUTION: carcinogenic, sensitizing and hazardous to aquatic environment. |
| HincII | New England Biolabs | R0103S | supplied with NEBuffer 3.1 |
| Hybridiser HB-1D | Techne | FHB4DD | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Kapa Biosystems | KK2602 | |
| Lysis buffer | 50 mM EDTA, 20 mM HEPES, NaCl 75 mM, Proteinase K (200 µg/mL), 1% SDS | ||
| Micro tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Microcentrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000014 | |
| Microcentrifuge MiniStar silverline | VWR | 521-2844 | |
| Multiply µStripPro 0.2 mL tube | Sarstedt | 72.991.992 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| Phenol – chloroform – isoamyl alcohol (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 26764.232 | dissolve in nuclease-free H2O for 3 M solution, sterile filter |
| Potassium hydroxide (KOH) | VWR | 26668.296 | dissolve in nuclease-free H2O for 3 M solution, sterile filter |
| Proteinase K | Ambion | AM2546 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32850 | CAUTION: Contains flammable and toxic components |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | CAUTION: Contains flammable and toxic components |
| Refrigerated Centrifuge 4K15 | Sigma Laboratory Centrifuges | No. 10740 | |
| SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553-035 | |
| Sodium acetate buffer solution, pH 5.2, 3 M (NaAc) | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| Sodium chloride (NaCl) | VWR | 27810.295 | dissolve in nuclease-free H2O for 5 M solution, sterile filter |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (3' phosphatase minus) | New England Biolabs | M0236L | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204L | supplied with PEG 8000 (50%) |
| T7 DNA Polymerase (unmodified) | New England Biolabs | M0274S | supplied with 10x T7 DNA Polymerase Reaction Buffer |
| TE Buffer | Invitrogen | 12090015 | |
| ThermoMixer F2.0 | Eppendorf | 5387000013 |
References
- Traut, T. W. Physiological Concentrations of Purines and Pyrimidines. Mol. Cell. Biochem. 140, 1-22 (1994).
- McElhinny, S. A. N., et al. Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 4949-4954 (2010).
- Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17, 350-363 (2016).
- Clausen, A. R., Zhang, S., Burgers, P. M., Lee, M. Y., Kunkel, T. A. Ribonucleotide incorporation, proofreading and bypass by human DNA polymerase delta. DNA Repair. 12, 121-127 (2013).
- Potenski, C. J., Klein, H. L. How the misincorporation of ribonucleotides into genomic DNA can be both harmful and helpful to cells. Nucleic Acids Res. 42, 10226 (2014).
- Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. RNase-sensitive DNA modification(s) initiates S. pombe mating-type switching. Gene. Dev. 18, 794-804 (2004).
- Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. Ribonucleotides Are Signals for Mismatch Repair of Leading-Strand Replication Errors. Mol. Cell. 50, 437-443 (2013).
- Ghodgaonkar, M. M., et al. Ribonucleotides Misincorporated into DNA Act as Strand-Discrimination Signals in Eukaryotic Mismatch Repair. Mol. Cell. 50, 323-332 (2013).
- DeRose, E. F., Perera, L., Murray, M. S., Kunkel, T. A., London, R. E. Solution Structure of the Dickerson DNA Dodecamer Containing a Single Ribonucleotide. Biochemistry. 51, 2407-2416 (2012).
- Li, Y. F., Breaker, R. R. Kinetics of RNA degradation by specific base catalysis of transesterification involving the 2 ‘-hydroxyl group. J. Am. Chem. Soc. 121, 5364-5372 (1999).
- McElhinny, S. A. N., et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA. Nat. Chem. Biol. 6, 774-781 (2010).
- Berglund, A. K., et al. Nucleotide pools dictate the identity and frequency of ribonucleotide incorporation in mitochondrial DNA. Plos Genet. 13, (2017).
- Brown, J. A., Suo, Z. C. Unlocking the Sugar “Steric Gate” of DNA Polymerases. Biochemistry. 50, 1135-1142 (2011).
- Sparks, J. L., et al. RNase H2-Initiated Ribonucleotide Excision Repair. Mol. Cell. 47, 980-986 (2012).
- Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. The Major Roles of DNA Polymerases Epsilon and Delta at the Eukaryotic Replication Fork Are Evolutionarily Conserved. Plos Genet. 7, (2011).
- Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 185-191 (2015).
- Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. Ribose-seq: global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA. Nat. Methods. 12, 251 (2015).
- Keszthelyi, A., Daigaku, Y., Ptasinska, K., Miyabe, I., Carr, A. M. Mapping ribonucleotides in genomic DNA and exploring replication dynamics by polymerase usage sequencing (Pu-seq). Nat. Protoc. 10, 1786-1801 (2015).
- Ding, J., Taylor, M. S., Jackson, A. P., Reijns, M. A. M. Genome-wide mapping of embedded ribonucleotides and other noncanonical nucleotides using emRiboSeq and EndoSeq. Nat. Protoc. 10, 1433-1444 (2015).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17, 10-12 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10, (2009).
