同時マッピングとヒトのミトコンドリア DNA のリボヌクレオチドの定量

このプロトコル概要を 図 1 と gDNA、アルカリ加水分解処理リボヌクレオチド、数を量的に表わすことができるに制限の酵素と消化の分離が含まれていますgDNA、無料 5´-オハイオ州の端のリン酸化、アダプター、2 番目の鎖の合成、およびシーケンスの前に PCR 増幅の ssDNA 結紮組み込まれてリボヌクレオチドのリン酸ジエステル結合。 1 アダプターおよびインデックス プライマー ARC78 ARC107、アダプター ARC76/77 オリゴヌクレオチド ARC140 を取得 ARC49 のインデックス プライマー (表 1 を参照)。 。 注: オリゴヌクレオチドは、HPLC 精製をする必要があります。ARC76/77 二重として並べ。 トリス EDTA (TE) バッファー内の各のオリゴヌクレオチドの準備 100 μ M 原液 (材料表 参照)-20 デパートと ° C は、溶出バッファー (EB; 参照 テーブルの材料) で希釈することによって ARC67/77 の 10 μ M ソリューションと ARC49、インデックスのプライマーの 2 μ M ソリューションを準備します。-20 ° C にてストア 2。成長と細胞の収穫 70 mL ダルベッコの成長 HeLa 細胞 ' s 修正イーグル培地 (DMEM) 37 で 250 mL スピナー フラスコの 10% 牛胎児血清を添加した ° C セルの数を数えると 200 x g で 5 分間遠心分離 50 mL チューブに 5 x 10 の 6 セルを収集し、上澄みを廃棄します。 20 mL の 1x PBS、200 x g で 5 分間遠心分離と細胞を洗浄し、上澄みを廃棄します。 -20 ° C でペレットを凍結または DNA の浄化を続行します。 3。DNA の精製と定量 フェノール-クロロホルム抽出法を使用して下記のとおり gDNA を浄化します。 は、2 mL の溶解バッファーで細胞を再懸濁します (材料の表 を参照) と暖房のブロックの 42 ° C で 30 分間インキュベートします 。 注意: 換散バッファーには、有害なコンポーネントが含まれています。SDS ソリューションは刺激、プロテイナーゼ K は感、刺激、および有毒です。防護服と手袋を着用します。 2 つの 2 mL チューブにサンプルを分割し、フェノール ・ クロロホルム ・ イソアミル アルコール (25:24:1) の 1 巻 (V) を追加します 。 注意: フェノール ・ クロロホルム ・ イソアミル アルコールは毒性、変異原性、腐食性、水生環境に危険をもたらすです。発煙のフードを使用して、防護服と手袋を着用、特殊フェノール クロロホルム廃棄物の破棄します。 室温で 30-60 秒の逆転や 15,000 x で 5 分間遠心分離による ミックス g. 注: 結果を歪める、ランダムな鎖切断を導入することを避けるためにない渦 DNA はありません。 上、水性相を新しい 2 mL のチューブに転送し、フェノール ・ クロロホルム ・ イソアミル アルコール (25:24:1) の 1 V を追加します。 ミックスの逆転や 4 で 15,000 × g で 5 分間遠心 ° C を新しい 2 mL チューブ 20 μ L を追加し上部の水様段階転送塩化ナトリウム (5 M) と冷たいイソプロパノールの 1 V 。 注意: イソプロパノールは、刺激性、可燃性、有毒です。換気されたキャビネットに格納、防護服と手袋を着用、炎から離しておく。 反転でミックスし-20 で少なくとも 1 時間インキュベート ° C G、4 ° C と破棄清 x 15,000 で 20 分間遠心します。 200 μ L 冷たい 70% エタノールで洗浄 DNA の餌は 4 ° C で 15,000 × g で 20 分間遠心し、上澄みを廃棄します 。 注意: 70% のエタノールは可燃性および刺激です。換気されたキャビネット、防護服と手袋、-20 ° C、それ以外の店で働く解決策を保持し、炎から離しておく。 20-25 分の室温で DNA ペレットを乾燥 溶解 DNA ペレット 100 μ L TE バッファーに格納し、プールの 1 つの管のサンプル。 メーカーによると dsDNA 定量試薬を用いた量的 DNA 濃度 ' s 仕様 (材料の表 を参照してください). 注: 残留フェノールによって DNA の吸光光度定量に影響するので dsDNA 定量試薬を使用しています。 -20 ° C でストア DNA HincII 治療を続行か。 4。HincII 治療とアルカリ加水分解 5 μ L 10 x バッファー 3.1、1 μ L (10 U) を含む 反応における DNA のダイジェスト 1 μ g ミックス HincII とヌクレアーゼ フリー H 2 O 50 μ L の最終巻にします 。 注: 結紮のための最適な条件を達成するために 2 番目の鎖合成や PCR 増幅、必要がありますそれはリボヌクレオチドの数が非常に少ないが、DNA に含まれていることが予想される場合、入力の DNA の量を増やすには。同様に、リボヌクレオチドの数が非常に高い場合、入力の DNA を減少する必要があります。 37 ° C で 30 分間インキュベート 浄化 HincII 常磁性ビーズで DNA を扱われます 。 注意: チューブ チューブを開くことでペレットを邪魔しないように次の手順で蓋を開きます。 常磁性ビーズをそれぞれの 1.8 V を追加サンプル、ピペッティング、ミックスを慎重に、10 分間室温でインキュベート 5 分のビーズをペレット、削除し、上澄みを廃棄する磁気ラックを使用します。 約 30 s し削除破棄上清の 70% のエタノール (室温) の 150 μ L でペレットを洗うです。 洗浄の 70% のエタノール (室温) 約 30 の 200 μ L でペレット s を削除し、上清を捨てる 。 注: 残留エタノールを 10 μ L ピペットを削除できます。水滴が簡単にあらかじめスピンダウンを。 乾燥室温約 15-20 分のサンプル 注: 正確な時間量のビーズ、ペレットの形状に依存し、したがってペレットが視覚的にチェックする必要があります。 磁気ラックからチューブを外し、45 μ L EB、慎重にピペッティングによるミックスでペレットを溶出します。 インキュベート 5 分、磁気ラックのビーズをペレットし、4.4 の手順で浄化された DNA の 45 μ L を使用します。 島 (3 M) または KCl (3 M) DNA を 50 μ L の総ボリュームを作成するための追加の 5 μ L. 注意: 3 M KOH 溶液は腐食性です。防護服と手袋を着用します。 氷 5 分続いて、交配で 55 ° C で 2 時間加温 オーブン メモ: それはチューブの均一加熱を維持し、蓋に結露を防ぐため暖房のブロックではなくオーブンで島治療を実行する勧めします。 酢酸ナトリウム 10 μ L を追加することによって を沈殿させる DNA (3 M, pH = 5.2) と 125 μ L 冷たい 100% エタノール。氷上で 5 分間インキュベート 注意: 100% エタノールは可燃性および刺激です。換気されたキャビネットに格納、防護服と手袋を着用、炎には近づかない。 21,000 x g、5 分の 4 ° C で遠心分離によって gDNA をペレットし、上澄みを廃棄します。 洗浄 DNA ペレット 250 μ L 冷たい 70 %etoh、21,000 x g、5 min のための 4 ° C で遠心し、上澄みを廃棄します 。 注: 液滴を削除するチューブがスピン ダウン簡単に再びし、10 μ l ピペットで上澄みを削除できます。 任意の目に見える流体が蒸発するまで約 5-10 分のための開いた管の乾燥ペレットをしましょう。 20 μ L EB 室温で 30 分間で聞かせて DNA ペレット溶解します。 5。 5´ リン酸化エンド が事前に短所は、各サンプルで反応混合物を備えます。T4 ポリヌクレオチド キナーゼ反作用バッファー、1 μ L (10 U) 3´ ホスファターゼ マイナス T4 ポリヌクレオチド キナーゼおよび 2.5 μ L ATP (10 mM) x 2.5 μ 10 の置かれて。 転送 19 μ L 各 DNA の新しい 200 μ L チューブにサンプルし、熱 cycler で 85 ° C で 3 分間変性します。 クールな DNA が氷の上をサンプリングし、各サンプルに反作用の組合せの 6 μ L を追加します。 30 分の停止反応 65 ° C 20 分でサンプルをインキュベートし 37 ° C で加温反応ミックス としての DNA の浄化は 4.3、常磁性ビーズの 1.8 V を使用して説明されていますが、14 μ L EB で溶出します。 6 ssDNA 結紮 が 0.5 μ l ATP (2 mM)、5 μ l 10 T4 RNA リガーゼの反応バッファー、5 μ l CoCl 3 (NH 3) 6 (10 mM)、x から成る事前に各サンプルの反応混合物を準備。0.5 μ L ARC140 (100 μ M)、および 25 μ L 50% PEG 8000。ピペッティングで混ぜるします 。 注意: CoCl 3 (NH 3) 6 は感作、発癌性、水生環境に有害です。防護服と手袋を着用します。 転送 13 μ L から浄化された DNA の新しい 200 μ L チューブ ステップ 5.5 と熱 cycler で 85 ° C で 3 分間変性します。 氷の DNA をクールな各サンプルは、ピペッティングにより混合反応混合物を 36 μ l 添加し、簡潔にスピンダウンします。 追加 1 μ L (10 U) T4 RNA リガーゼの各反応に、ピペッティングで混ぜるし、簡単にスピンダウンします。 暗い夜間の室温でサンプルをインキュベートします。 7。第 2 鎖合成 4.3 で説明したように、浄化が DNA を結紮が 0.8 V 常磁性ビーズを使用して、10 分のビーズをペレットし、20 μ L EB で溶出します 。 注: ライゲーション反応混合物の粘度が高いためペレット化の第一歩は延長します。 新しい 200 μ L の PCR チューブに DNA サンプルの 転送 20 μ L。0.8 V 次の製造元常磁性ビーズを用いた浄化手順 ' s 仕様には 14 μ L EB と。 10 x T7 DNA ポリメラーゼ反応バッファー、2 μ L の 2 μ L から成る事前に各サンプルの反応混合物を準備 ARC76/77 (2 μ M)、2 μ L dNTPs (2 mM) と 0.8 μ L BSA (1 mg/mL). 転送 12.8 μ L が新しい 200 μ L 管へ DNA を精製し、熱 cycler で 85 ° C で 3 分間変性します。 氷の DNA を冷却し、それぞれのサンプル、ピペッティングで混ぜる、簡潔に、スピンダウン、室温で 5 分間インキュベートする反作用の組合せの 6.8 μ L を追加します。 各反応に 0.4 μ L (4 U) T7 DNA ポリメラーゼを追加し、室温で 5 分間インキュベートします。 常磁性ビーズの 0.8 V を使用して 4.3、記載としての DNA の浄化し、11 μ L EB で溶出します。 8。PCR 増幅とライブラリ定量 前もって 7.5 μ L から成る 準備新しい 200 で各サンプルに対して反作用の組合せ μ 管 ARC49 (2 μ M)、7.5 μ L インデックス プライマー (2 μ M、サンプルごとにユニークな)、およびホット スタート x 25 μ L 2レディ ミックス。 各反応する DNA のサンプルの追加 10 μ L。次の条件を使用してライブラリを増幅する: 45 95 ° C で変性 15 98 ° C の 18 サイクルに続いて s s、65 ° C、30 s 72 ° C、30 秒、2 分保持するサンプル 4 ° 72 ° C で最終伸長で終わる増幅後 C. 4.3、0.8 V 常磁性ビーズを使用しての説明に従ってライブラリを浄化し、20 μ L TE バッファーで溶出します。 、メーカーによると dsDNA 定量試薬を使用してライブラリを量的に表わす ' s 仕様 (材料の表 を参照してください). -20 ° C でサンプルを格納またはライブラリの分析を続行します。 9。ライブラリの分析とプール 各ライブラリの品質を決定する、デジタル電気泳動システムを使用してフラグメントの平均サイズを予測します 。 注: 平均フラグメントのサイズは一塩の曲線下面積は半分になる、推定による評価はマーカーからピークを無視して。島または KCl 治療後適切なライブラリ プロファイルの代表の結果は、 図 2 a で与えられる。 計算ライブラリとしての濃度 (nM): (c/10 3)/(p*650)] * 10 9 c が ng/μ L のライブラリの濃度にあり、p は bp、平均フラグメント サイズに推定される 9.1。 プール モルの平等な金額まで 24 ライブラリは、別のインデックス配列のプライマーで増幅。25 μ L の最終巻と 10 の濃度に TE バッファーを追加 nM 。 注: プールするライブラリの数、に応じて各ライブラリからの DNA の量が調整されます。約 130 の明瞭なピークとして 9.1 をステップしたプライマー二量体が検出された場合 0.8 V 常磁性ビーズを用いた 4.3 で説明されているように精製ステップが繰り返されますので 25 μ L TE buf に DNA を溶出、bp、ライブラリ プールの最終巻は 25 μ L を超えることfer。 を決定するメーカーによると dsDNA 定量試薬を用いた新しいライブラリ プール濃度 ' s 仕様と平均ピーク サイズ上記のよう。シーケンスとデータ解析 (セクション 10 および 11) に進みます。 10。シーケンス プールされたライブラリ 12 75 ベース ペアエンド シーケンスを実行します。 11 データ分析 トリム アダプター シーケンスを削除するすべての読み取りフィルターの品質と長さを読む。 。 メモ: これは実行することができますコマンドで cutadapt 1.2.1 20 を使用 ‘ cutadapt -f fastq – 試合-読み取り-ワイルドカード – 静かな m 15 – q 10-、NNNNNNN < ファイル >’ NNNNNNN は実際アダプター シーケンスに置き換えられます場所、および < ファイル > はfastq ファイル名に置き換えられます。 カスタム スクリプトを使用して、前の手順で廃棄された読み取りの合致を削除します。 残りの合わせメイト 1 組ライブラリの準備で使用されるすべてのオリゴヌクレオチドのシーケンスを含むインデックスを (例えば、 ボウタイ 0.12.8 21 とコマンド ・ ラインを使用してオプション – m1-v2)。成功した線形のすべてのペアを破棄します。 生物参照ゲノムをコマンドラインでボウタイを使用して残りのペアを揃えるオプション – v2 X 10000–最高。 地図が不整列のすべてのペアのメイト 1 を合わせ、そのミトコンドリアの分子の先頭と末尾の間を読み取り (ボウタイを用いたコマンド ライン オプション – v2). は、すべてのシングルとペアの最後の線形の 5´ エンドの数を決定します。加水分解のリボヌクレオチドがいた位置に一塁上流によってこれらの位置をシフトします。 ボウタイ ファイルからデータをエクスポートは、ゲノム ブラウザー共通の可視化のためのカスタム スクリプトを使用して bedgraph ファイル形式にフォーマットします。読み取りごとに各ストランドの読み取りを正規化百万。 Incorp のアイデンティティを決定する有機体のゲノム塩基配列を参照位置とカウントを使用して、bedgraph ファイルからリボヌクレオチドの代表 orated 。 注: 16,200 300 の 5,747 5,847 の地域から人間のミトコンドリアのゲノムを読み取りのそれぞれの鎖除外すべきこれらの地域を含む多くの無料 5´ の両端が DNA ポリメラーゼ γ によってリボヌクレオチド定款とは無関係なので。 ない 11 HincII サイトを単一鎖切断、(すなわち ミトコンドリア分子当たりリボヌクレオチドの数) あたりのリボヌクレオチドの番号を取得する HincII サイトごとの読み取りの平均数と読み取りを含めて合計読み取りを分割します。