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Biology

La cartographie simultanée et au dosage des ribonucléotides dans l’ADN Mitochondrial humain

Published: November 14, 2017
doi:
10.3791/56551
, ,
1Department for Medical Biochemistry and Cell Biology,University of Gothenburg, 2Department of Biology and Biological Engineering,Chalmers University of Technology

Summary

Nous décrivons ici une méthode se prête pour doser simultanément et ribonucléotides pangénomique carte en ADN hautement intact à résolution mononucléotidiques, combinant un clivage enzymatique de l’ADN génomique avec son hydrolyse alcaline et ultérieur 5´-fin séquençage.

Abstract

Des approches établies pour estimer le nombre des ribonucléotides présents dans un génome se limitent à la quantification des ribonucléotides incorporés à l’aide de courts fragments d’ADN synthétiques ou plasmides en tant que modèles et puis en extrapolant les résultats à l’ensemble génome. Alternativement, le nombre des ribonucléotides présents dans un génome peut être estimé à l’aide de gels alcalines ou buvardages. In vivo des approches plus récentes emploient séquençage de nouvelle génération permettant de génome cartographie des ribonucléotides, fournissant la position et l’identité des ribonucléotides incorporés. Toutefois, ils ne permettent pas de quantification du nombre de ribonucléotides qui sont incorporés dans un génome. Ici, nous décrivons comment carte simultanément et de quantifier le nombre de ribonucléotides qui sont incorporés dans l’humain mitochondrial DNA in vivo par séquençage de prochaine génération. Nous utilisons des ADN hautement intact et introduire la séquence double brins spécifique par elle à digérer avec une endonucléase, par la suite hydrolysant ribonucléotides incorporés avec de l’alcali. Les extrémités générées sont ligaturées avec adaptateurs et ces extrémités sont séquencées sur une machine de séquençage de prochaine génération. Le nombre absolu de ribonucléotides peut être calculé comme le nombre de lectures en dehors du site de reconnaissance par nombre de lectures sur le site de reconnaissance pour l’endonucléase spécifique de séquence. Ce protocole peut également être utilisé pour mapper, puis doser gratuits pseudos dans l’ADN et permet l’adaptation mapper les autres lésions de l’ADN qui peuvent être traitées à 5´-OH bouts ou les extrémités 5´-phosphate. En outre, cette méthode peut être appliquée à n’importe quel organisme, étant donné qu’un génome de référence approprié est disponible. Ce protocole prévoit par conséquent un outil important pour étudier la réplication de l’ADN, le traitement de 5´-fin, dommages à l’ADN et réparation de l’ADN.

Introduction

Dans une cellule eucaryote, la concentration des ribonucléotides (RN) est beaucoup plus élevée que la concentration de désoxyribonucléotides (dNTPs)1. ADN polymérases discriminent les ribonucléotides, mais cette discrimination n’est pas parfaite, et, en conséquence, ribonucléotides au lieu de désoxyribonucléotides peuvent être incorporés dans les génomes au cours de la réplication de l’ADN. Ribonucléotides est peut-être les plus courantes nucléotides non-canoniques incorporés dans le génome2. La plupart de ces ribonucléotides est supprimée au cours de la maturation du fragment Okazaki de réparation par excision de RNase H2 ribonucléotide initiés (RER) ou par la topoisomérase 1 (revu en référence3). Ribonucléotides qui ne peuvent pas être supprimés restent stable incorporés dans l’ADN2,4 et il peuvent affecter de manières fois nuisibles et bénéfiques (revu en revue5). En plus d’être capable d’agir comme des signaux positifs, par exemple dans l’accouplement de type commutateur Schizosaccharomyces pombe 6 et marquant le brin d’ADN naissant au cours de l’incompatibilité de réparer (MMR)7,8, ribonucléotides affectent la 9 de la structure et la stabilité de l’ADN environnante en raison de le 2´-hydroxyle de leurs ribose10, ayant pour résultat réplicative stress et génome instabilité11. L’abondance des ribonucléotides dans l’ADN génomique (ADNg) et leur pertinence dans la réplication et les mécanismes de réparation, ainsi que les implications pour la stabilité du génome, donner raison à enquêter sur leur présence précis et les fréquences d’une manière de génome.

L’activité RNase H2 n’a pas été trouvée dans les mitochondries humaines et ribonucléotides ne sont donc pas efficacement éliminés par l’ADN mitochondrial (ADNmt). Plusieurs voies sont impliqués dans la fourniture de nucléotides aux mitochondries humaines et afin de vérifier si les perturbations dans le pool des nucléotides mitochondrial provoquent un nombre élevé de ribonucléotides dans ADN mitochondrial humain, nous avons développé un protocole pour la carte et à quantifier Ces ribonucléotides en ADNmt humain isolé de fibroblastes, cellules HeLa et cellule patient lignes12.

La plupart in vitro approches (examinées par révisé13) pour déterminer la sélectivité des ADN polymérases contre RN sont fondées sur les expériences d’extension d’insertion ou amorce de ribonucléotide unique où les concurrents RN est inclus dans la réaction mélanger, ce qui permet l’identification ou la quantification relative de l’incorporation de ribonucléotide dans quelques modèles d’ADN. Approches quantitatives sur courtes séquences ne peuvent pas refléter dNTP et rNTP piscines à des concentrations cellulaires et donc fournir aperçu de sélectivité de la polymérase, mais sont d’une importance limitée au sujet de génomes entiers. Il a été démontré que la quantité relative de ribonucléotides constituée au cours de la réplication d’une matrice d’ADN plus long, comme un plasmide, peut être visualisée sur un gel de séquençage à l’aide des dNTPs radiomarquées et hydrolyse de l’ADN dans un milieu alcalin14. En outre, gDNA a été analysée sur buvardages après hydrolyse alcaline, ce qui permet de volet spécifique de palpage et détermination des taux absolus de ribonucléotide incorporation in vivo15. Ces approches permettent une comparaison relative de fréquence d’incorporation, mais n’offrent aucun aperçu de la position ou l’identité des ribonucléotides incorporés. Approches plus récentes à analyser le contenu de ribonucléotide dans ADNg in vivo, comme HydEn-Seq16, Ribose-Seq17, Pu-Seq18ou19d’emRiboSeq, profitez des ribonucléotides incorporés sensibilité aux alcalins ou traitement de RNase H2, respectivement et employer le séquençage de prochaine génération pour identifier des ribonucléotides Génome-large. Ces méthodes ne fournissent pas d’aperçu de la fréquence absolue d’incorporation des ribonucléotides détectés. En ajoutant la marche du clivage enzymatique spécifique de la séquence du protocole HydEn-seq, la méthode que nous décrivons ici idéalement étend l’information obtenue grâce à une approche du séquençage, permettant une cartographie simultanée et intégrée de la quantification de la ribonucléotides12. Cette méthode s’applique à pratiquement n’importe quel organisme, étant donné que des extraits d’ADN hautement intacts peuvent être générés et un génome de référence approprié est disponible. La méthode pourrait être adaptée pour quantifier et déterminer l’emplacement de toute lésion qui peut être digérée par une nucléase et laisse un 5´-phosphate ou une fin de 5´-OH.

Pour la carte et à quantifier les ribonucléotides dans l’ADN génomique, la méthode combine un clivage par une endonucléase spécifique de la séquence et l’hydrolyse alcaline générant 5´-phosphate termine sur les sites où se trouve la séquence de reconnaissance spécifique de l’endonucléase et 5´- OH se termine aux positions où se trouvaient les ribonucléotides. Puisque les extrémités libres générées sont ensuite ligaturées avec adaptateurs et séquencé le séquençage de nouvelle génération, il est important d’utiliser ADN hautement intact et éviter la fragmentation aléatoire au cours de la préparation d’ADN d’extraction et de la bibliothèque. Évaluation de ces lectures normalisés pour le lit sur les sites de clivage endonucléase permet une quantification simultanée et la cartographie des ribonucléotides détectés. 5´-extrémités libres sont détectés dans des expériences de contrôle où l’hydrolyse alcaline de l’ADN est remplacée par un traitement avec KCl. Les données acquises donnent un aperçu de ribonucléotide emplacement et la quantité et permet des analyses en ce qui concerne la fréquence contenu et incorporation de ribonucléotide.

Protocol

le présent protocole est décrit à la Figure 1 et comprend à l’isolement de l’ADNg, digestion par des enzymes de restriction pour pouvoir quantifier le nombre de ribonucléotides, traitement à l’alcali à hydrolyser les liaisons phosphodiester des ribonucléotides incorporé dans l’ADNg, la phosphorylation des extrémités libres 5´-OH, ssDNA ligature des adaptateurs, synthèse du deuxième brin et amplification PCR avant séquençage. 1. adaptateurs et amorces Index ARC49 obtenir, oligonucléotides ARC140, ARC76/77, adaptateur et ARC78-ARC107 des amorces index (voir tableau 1). Remarque : Les oligonucléotides devraient être HPLC purifiée. ARC76/77 sont classés comme duplex. Solutions mères de préparer 100 µM de chaque oligonucléotide dans un tampon Tris-EDTA (TE) (voir la Table des matières) et conserver à -20 ° C. Solutions solutions de préparer 10 µM de ARC67/77 et 2 µM d’amorces ARC49 et index en diluant dans la mémoire tampon d’élution (EB ; Voir la Table des matières). Conserver à-20 ° C. 2. La croissance et la récolte des cellules cellules HeLa croître dans 70 mL Dulbecco ' s Modified Eagle moyenne (DMEM) additionné de sérum de veau fœtal de 10 % dans un ballon jaugé de 250 mL Spinner à 37 ° C. Compter le nombre de cellules et collecter 5 x 10 6 cellules dans un tube de 50 mL, centrifuger pendant 5 min à 200 x g et éliminer le surnageant. Laver les cellules avec du PBS 1 x de 20 mL, centrifuger pendant 5 min à 200 x g et éliminer le surnageant. Geler les pellets à-20 ° C ou de continuer avec la purification de l’ADN. 3. Purification d’ADN et la quantification purifier ADNg utilisant l’extraction au phénol-chloroforme comme décrit ci-dessous. Remettre en suspension les cellules dans le tampon de lyse 2 mL (voir la Table des matières) et incuber 30 min à 42 ° C sur un bloc de chauffage. ATTENTION : Tampon de lyse contient des composants dangereux. Solution de SDS est irritante, protéinase K sensibilisantes, irritantes et toxiques. Porter des gants et des vêtements protecteurs. Diviser l’échantillon en deux tubes de 2 mL et ajouter 1 volume (V) de phénol-chloroforme-isoamylique alcool (25:24:1). ATTENTION : Phénol-chloroforme-isoamylique alcool est toxique, mutagène, corrosifs et dangereux pour les milieux aquatiques. Utiliser dans une hotte aspirante, porter des gants et des vêtements protecteurs et jeter dans les déchets spéciaux phénol-chloroforme. Mix par inversion de 30-60 s et centrifuger pendant 5 min à 15 000 x g à la température ambiante. Remarque : Ne pas vortex ADN pour éviter d’introduire des ruptures de brins aléatoire, ce qui fausseraient les résultats. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de 2 mL et ajouter 1 V de phénol-chloroforme-isoamylique alcool (25:24:1). Mix par inversion et centrifuger pendant 5 min à 15 000 x g à 4 ° C. Transférer la phase aqueuse supérieure pour une nouvelle 2 mL tube et ajouter 20 µL NaCl (5 M) et 1 V d’isopropanol froid. ATTENTION : Alcool isopropylique est inflammable, irritant et toxique. Entreposer dans une armoire ventilée, porter des gants et des vêtements protecteurs et gardez-le éloigné des flammes. Mix par inversion et incuber pendant au moins 1 h à -20 ° C. Centrifugeuse pendant 20 min à 15 000 x g, 4 ° C puis jeter le surnageant. Granule d’ADN de lavage avec 200 µL 70 % éthanol froid, centrifuger pendant 20 min à 15 000 x g à 4 ° C et jeter le surnageant. ATTENTION : l’éthanol à 70 % est inflammable et irritant. Conserver la solution de travail à-20 ° C, sinon magasin en armoire ventilée, portez des vêtements protecteurs et des gants et gardez-le éloigné des flammes. Sécher le culot d’ADN à température ambiante pendant 20 à 25 min. Boulettes ADN dissoudre dans 100 µL TE mettre en mémoire tampon et mettre en commun les échantillons dans un tube. Concentration d’ADN de quantifier à l’aide d’un réactif de quantification ADN double brin selon fabricant ' s spécifications (voir la Table des matières). Remarque : Utilisez un réactif de quantification ADN double brin, parce que le dosage spectrophotométrique de l’ADN peut être affectée par le phénol résiduel. Banque d’ADN à-20 ° C ou continuer avec traitement HincII. 4. Traitement HincII et hydrolyse alcaline mix Digest 1 µg d’ADN dans une réaction contenant 5 µL 10 x tampon 3.1, 1 µL (10 U) HincII et exempte de nucléase H 2 O pour un volume final de 50 µL. Remarque : Pour obtenir des conditions optimales pour la ligature, synthèse du deuxième brin et amplification par PCR, il peut être nécessaire d’augmenter la quantité d’ADN d’entrée si il est prévu que l’ADN contient un nombre très faible de ribonucléotides. De même, il peut être nécessaire de diminuer l’ADN d’entrée si le nombre des ribonucléotides est très élevé. Incuber 30 min à 37 ° C. HincII purifier traités ADN avec billes paramagnétiques. Remarque : Maintenez le tube couvercles ouvrent dans les étapes suivantes pour ne pas déranger les granulés en ouvrant les tubes. Ajouter 1,8 V de perles paramagnétiques à chaque échantillon, il faut mélanger soigneusement en pipettant également et incuber à température ambiante pendant environ 10 minutes Utiliser une grille magnétique à pellet les perles pendant 5 min, puis retirer et jeter le surnageant. Laver le culot avec 150 µL d’éthanol à 70 % (température ambiante) pendant environ 30 s puis retirer et jeter le surnageant. Laver le culot avec 200 µL d’éthanol à 70 % (température ambiante) pour environ 30 s puis retirer et jeter le surnageant. Remarque : L’éthanol résiduel peut être enlevé avec une pipette de 10 µL. Gouttelettes peuvent être tournés vers le bas brièvement au préalable. Sécher les échantillons à température ambiante pendant environ 15-20 min. Remarque : L’heure exacte dépend du volume de perles et la forme du projectile, donc les pellets doivent être vérifiés visuellement. Retirer les tubes de la grille magnétique et éluer culot dans 45 µL EB, mélange de pipetage soigneusement. Incuber pendant 5 min, puis les perles sur le support magnétique de granule et utiliser 45 µL d’ADN purifié à l’étape 4.4. Ajouter 5 µL de KOH (3 M) ou de KCl (3M) à l’ADN création d’un volume total de 50 µL. ATTENTION : 3 M KOH solution est corrosif. Porter des gants et des vêtements protecteurs. Incuber pendant 2 h à 55 ° C, une hybridation in four suivie de 5 min sur glace Remarque : Il est recommandé d’effectuer le traitement de KOH dans un four plutôt que d’un bloc de chauffage pour maintenir un chauffage uniform du tube et de prévenir la condensation sur le couvercle. ADN précipité par addition d’acétate de sodium 10 µL (3M, pH = 5,2) et 125 µL d’éthanol froid 100 %. Incuber sur glace pendant 5 min. ATTENTION : 100 % d’éthanol est inflammable et irritant. Stocker dans une armoire ventilée, porter des gants et des vêtements de protection et tenir éloigné des flammes. à pellets ADNg par centrifugation à 21 000 x g, 4 ° C pendant 5 min et éliminer le surnageant. Lavage ADN granule avec 250 µL froid 70 % EtOH, centrifuger à 21 000 x g, 4 ° C pendant 5 min et éliminer le surnageant. Remarque : Pour éliminer les gouttelettes, le tube peut être filé vers le bas, brièvement à nouveau et le surnageant peut être enlevée avec une pipette de 10 µl. Sécher le culot dans un tube ouvert pendant environ 5-10 min jusqu’à évaporation de n’importe quel fluide visible. Let ADN pellet se dissolvent dans 20 µL EB pendant 30 min à température ambiante. 5. 5´ la Phosphorylation fin préparer le mélange de réaction pour chaque échantillon à l’avance contreisting 2,5 µl 10 x tampon de réaction polynucléotide kinase T4, 1 µL (10 U) 3´-phosphatase-minus T4 polynucléotide kinase et 2,5 µL ATP (10 mM). Transfert 19 µL de chaque ADN l’échantillon dans un nouveau tube de 200 µL et dénaturer pendant 3 min à 85 ° C dans un thermo-cycler. Cool ADN d’échantillons sur la glace et ajouter 6 µL du mélange réactionnel à chaque échantillon. Mélange de réaction incuber à 37 ° C pendant 30 minutes et arrêter la réaction en incubant les échantillons à 65 ° C pendant 20 min. Purifier l’ADN comme décrit en 4.3, à l’aide de 1.8 V de billes paramagnétiques mais éluer à 14 µL EB. 6. ADNsb ligature préparer le mélange de réaction pour chaque échantillon consistant à l’avance de 0,5 µL ATP (2 mM), 5 µL 10 x tampon de réaction T4 ARN ligase, 5 µL CoCl 3 (NH 3) 6 (10 mM), 0,5 µL ARC140 (100 µM) et 25 µL 50 % PEG 8000. Mélangez bien en pipetage. ATTENTION : CoCl 3 (NH 3) 6 est cancérigène, sensibilisant et dangereux pour l’environnement aquatique. Porter des gants et des vêtements protecteurs. Transfert 13 µL d’ADN purifié d’étape 5.5 dans un nouveau tube de 200 µL et dénaturer pendant 3 min à 85 ° C dans un thermo-cycler. Refroidir l’ADN sur la glace et ajouter 36 µL du mélange de réaction pour chaque échantillon, la composition de pipetage et tournez en bas brièvement. Ajouter 1 µL (10 U) de T4 ARN Ligase à chaque réaction, mélanger en pipettant également et tournez en bas brièvement. Incuber les échantillons à la température ambiante dans la nuit sombre. 7. Synthèse du deuxième brin purifier ligaturé ADN comme décrit en 4.3, mais utiliser 0,8 V de billes paramagnétiques, les perles pour 10 min de granule et éluer dans 20 µL EB. Remarque : En raison de la viscosité plus élevée du mélange de réaction de la ligature, la première étape de granulation se prolonge. Transfert 20 µL de l’échantillon d’ADN dans un nouveau tube PCR de 200 µL. Répétez l’étape de purification à l’aide de 0,8 V de billes paramagnétiques suivant le fabricant ' s spécifications et éluer à 14 µL EB. Préparer le mélange de réaction pour chaque échantillon d’avance consistant en 2 µL de tampon réaction de 10 x T7 l’ADN polymérase, 2 µL ARC76/77 (2 µM), 2 µL dNTPs (2 mM) et 0,8 µL BSA (1 mg/mL). Transfert 12,8 µL purifiée ADN dans un nouveau tube de 200 µL, dénaturer pendant 3 min à 85 ° C dans un thermo-cycler. Refroidir l’ADN sur la glace et ajouter 6,8 µL du mélange de réaction pour chaque échantillon, mixer en pipettant également, tournez brièvement en bas et incuber pendant 5 min à température ambiante. Ajouter 0,4 µL (4 U) T7 DNA polymérase dans chaque réaction et incuber pendant 5 min à température ambiante. Purifier l’ADN comme décrit en 4.3, à l’aide de 0,8 V de billes paramagnétiques et éluer à 11 µL EB. 8. L’Amplification par PCR et quantification de la bibliothèque préparer le mélange de réaction pour chaque échantillon dans un nouveau 200 tube µL d’avance consistant en 7,5 µL ARC49 (2 µM), 7,5 µL indice primer (2 µM, unique pour chaque échantillon) et 25 µL 2 x démarrage à chaud prémélangé. Ajouter 10 µL de l’échantillon d’ADN de chaque réaction. Amplifier la bibliothèque en utilisant les conditions suivantes : dénaturation à 95 ° C pendant 45 s, suivie de 18 cycles de 98 ° C pendant 15 s, 65 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 30 s, se terminant par une élongation finale à 72 ° C pendant 2 min. attente échantillons à 4 ° C après amplification. Purifier des bibliothèques comme décrit en 4.3, à l’aide de 0,8 V de billes paramagnétiques et éluer dans 20 µL de tampon de TE. Quantifier des bibliothèques à l’aide d’un réactif de quantification ADN double brin, selon le fabricant ' s spécifications (voir la Table des matières). Conserver les échantillons à-20 ° C ou de continuer avec l’analyse de la bibliothèque. 9. Analyse de la bibliothèque et de la mise en commun déterminer la qualité de chaque bibliothèque et estimer la taille moyenne fragment à l’aide d’un système d’électrophorèse numérique. Remarque : La taille du fragment moyenne est évaluée en estimant où l’aire sous la courbe de l’électrophorégramme est réduit de moitié, sans tenir compte des pics de marqueurs. Les résultats représentatifs des profils de la bibliothèque appropriée après traitement KOH ou KCl sont donnés dans la Figure 2 a. Calculer la concentration (nM) des bibliothèques comme : (c/10, 3) /(p*650)] * 10 9 où c est la concentration de la bibliothèque de ng/µL et p est la taille moyenne de fragment dans bp, comme estimé au 9.1. Piscine molaires égales de jusqu’à 24 bibliothèques amplifiés avec des amorces d’indice différent pour le séquençage. Ajouter le tampon TE pour un volume final de 25 µL et la concentration de 10 nM. Remarque : Selon le nombre de bibliothèques à mettre en commun, la quantité d’ADN de chaque bibliothèque est réglée. Si les dimères d’amorces ont été détectés à l’étape 9.1 comme un pic distinct d’environ 130 bp, le dernier volume de la piscine de bibliothèque peut dépasser 25 µL, parce que l’étape de purification est répétée comme décrit en 4.3, à l’aide de 0,8 V de billes paramagnétiques, et ADN est élué dans 25 µL TE buf fer. Déterminer la concentration de piscine nouvelle bibliothèque à l’aide d’un réactif de quantification ADN double brin selon fabricant ' s spécifications et à la moyenne maximale taille tel que décrit ci-dessus. Procéder au séquençage et analyse de données (Articles 10 et 11). 10. Séquençage effectuer 75-base jumelé-fin séquençage sur bibliothèques regroupées 12. 11. analyse des données garniture toutes les lectures pour supprimer les séquences de l’adaptateur, filtrer pour qualité et lu longueur. Remarque : Cela peut être fait à l’aide de cutadapt 1.2.1 20 avec la commande ‘ cutadapt -f fastq–match-lecture-caractères génériques–quiet -m 15 – q 10 – un NNNNNNN < fichier >’, où NNNNNNN est remplacé par la séquence de l’adaptateur actuel et < fichier > est remplacé par le nom de fichier fastq. Enlever les camarades des lectures qui ont été ignorés dans l’étape précédente à l’aide de scripts personnalisés. Align Mate 1 restant paires à un index contenant la séquence d’oligonucléotides tous utilisés dans la préparation de la bibliothèque (p. ex., en utilisant le nœud papillon 0.12.8 21 et la ligne de commande options – m1-v2). Jetez toutes les paires avec succès alignements. Align paires restantes dans le génome de référence organisme utilisant noeud papillon avec la ligne de commande options – v2 -X 10000–meilleur. Carte lit cet intervalle entre le début de la molécule mitochondriale et la fin en alignant 1 compagnon de toutes les paires non alignés (à l’aide de noeud papillon avec la ligne de commande options – v2). Déterminer le nombre de 5´-ends pour tous les alignements de fin unique et appariés. Déplacer la position de ceux-ci par une base en amont sur la position où étaient les ribonucléotides hydrolysées. Exporter des données depuis le fichier bowtie format vers un format de fichier bedgraph à l’aide de scripts personnalisés pour la visualisation en commun des navigateurs du génome. Normaliser les lectures pour chaque brin de lectures par million. à l’aide de la position et les chefs d’accusation dans le fichier bedgraph, faire référence à la séquence du génome d’organisme pour déterminer l’identité d’incorporée des ribonucléotides. Remarque : Pour le génome mitochondrial humain indique des régions 16 200-300 et 5 747-5 847 pour chaque brin devrait être exclus étant donné que ces régions contiennent de nombreuses 5´-extrémités libres, sans lien avec incorporation de ribonucléotide par l’ADN polymérase γ. Diviser les lectures totales, sans compter les lectures sur les onze sites de HincII, avec le nombre moyen de lectures par le site HincII pour obtenir le nombre de ribonucléotides par coupure simple brin, (c’est-à-dire le nombre de ribonucléotides par molécule mitochondriale).

Representative Results

Illustrant la méthodologie décrites ci-dessus, représentante les données ont été générées analysant l’ADN mitochondrial humain de HeLa cellules12. Figure 2 b présente les résumés lectures à tous les sites HincII lourds (HS) et lumière strand (LS) de l’ADN mitochondrial humain après traitement de KCl (panneaux de gauche). Environ 70 % de toutes les 5´-extrémités détectés localiser vers les sites coupe, ce qui démontre la grande efficacité de la digestion HincII. Bibliothèques avec KOH à hydrolyser l’ADN à des ribonucléotides embarqués de traitement diminue le nombre de lectures sur les sites de HincII à environ 40 % (Figure 2 b, panneaux de droite). C’est prévu depuis un grand nombre de 5´-ends est généré sur les sites d’incorporation de ribonucléotide et témoigne d’une qualité suffisante de la bibliothèque. Figure 2 illustre la localisation et la fréquence de 5´-ends (vert) lors de la génération de lectures et traitement de KCl par HydEn-seq (magenta) après traitement de KOH, détecter les 5´-extrémités libres et extrémités générées à ribonucléotides par hydrolyse alcaline. 5´-extrémités libres et ribonucléotides localisation du système harmonisé de l’ADNmt humain apparaissent dans le panneau de gauche et ceux localisation à la LS sont affichés dans le panneau de droite. Le nombre relatif de lectures brutes à ribonucléotides (Figure 2D, panneau supérieur) ou des sites de HincII (panneau inférieur) sur HS et LS d’ADNmt montrent, respectivement, une couverture plus forte 14 fois ou 31-fold de la LS par rapport à SH, alors qu’un biais similaire n’a été observé pour les ADN nucléaire. Ce biais de brin peut s’expliquer par la nette différence dans la composition de base des deux brins et illustre l’importance de la normalisation de lectures sur les sites de HincII. Normaliser la lecture compte à HincII donne une mesure quantitative du nombre de ribonucléotides par génome mitochondrial (Figure 3 a). Comme illustré à la Figure 3 b, les lectures après que traitement de KOH pour chaque ribonucléotide normalisée à la composition de la séquence de chaque brin montrent un rapport différent de 1, ce qui indique une répartition non aléatoire des lectures suggérant un ribonucléotide distinct dessin et une qualité élevée de bibliothèque. Ce ratio n’est pas affecté par digestion précédente avec HincII, vérifier la spécificité de clivage de l’enzyme. Normaliser les lectures sur les sites des ribonucléotides intégrés à ceux de sites de clivage HincII, ainsi que le contenu de nucléotide du génome, génère une mesure quantitative de combien de chaque ribonucléotide est incorporés par 1 000 bases complémentaires ( Figure 3). Figure 1 : schéma de l’ADN et de la préparation de la bibliothèque. (1) l’ADN génomique tout est clivé par HincII pour la normalisation dans le dosage ultérieur des ribonucléotides, générant des extrémités franches à HincII sites (flèche noire). (2) l’ADN est traitée avec KOH s’hydrolyser dans les sites de ribonucléotide, menant à 2´, phosphate 3´-cyclique (Pentagone rouge) à la fin de 3´ et les extrémités libres 5´-OH. (3) 5´-OH extrémités sont phosphorylées par T4 polynucléotide Kinase 3´-phosphatase-minus. (4) toutes les 5´-extrémités transportant un groupe de phosphate sont ligaturés à l’oligonucléotide ARC140 par ligase d’ARN T4. (5) le deuxième volet est synthétisé à l’aide de l’ADN polymérase T7 et les ARC76-77 oligonucléotides contenant des séquences aléatoires de6 N. (6) la bibliothèque est amplifiée par une polymérase d’ADN haute fidélité à l’aide de ARC49 et l’autre de la ARC78 à ARC107 des amorces d’index contenant un code-barres unique pour le multiplexage. (7) 5´-extrémités sont trouvent par séquençage jumelé-fin. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : validation de la méthode. (A) représentant électrophérogrammes généré à l’aide d’un système d’électrophorèse automatisée pour déterminer la qualité de généré bibliothèques traités avec signal KOH ou KCl. (B) résumé à HincII sites lourds (HS) et lumière strand (LS) ADNmt humain après KCl (panneaux de gauche) ou traitement de KOH (panneaux de droite). Circos (C) la figure de 5´-extrémités libres (vert) et de HydEn-Seq (5´-extrémités libres et ribonucléotides, magenta) HS (panneau de gauche) et ADNmt humain LS (panneau de droite). Sommets sont normalisées à par millions lectures et la valeur de crête est ajusté au nombre maximal de lectures de la bibliothèque de HydEn-seq. (D) Résumé brut lit ribonucléotides (panneau du haut) et sites de HincII (panneau inférieur) à lourdes (H) et le brin de lumière (L) dans l’ADN mitochondrial humain (Mito.) ou en sens inverse (RV) ou avant (FW) rive, dans le nucléaire (Nuc). ADN. Les figures B, C et D sont adaptées de référence12. Barres d’erreur représentent l’écart-type de la moyenne. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : résultats représentant. (A), le parent le nombre des ribonucléotides normalisé au lit à HincII sites pour les bibliothèques KOH traité sur la lourde (H) ou un brin de lumière (L). Ratio (B) de l’identité de ribonucléotide de la composition du génome mitochondrial pour KOH traités (KOH) et HincII s’est fendue avec KOH traité (HincII + KOH) bibliothèques sur la lourde (H) ou légère (L) brin de l’ADN mitochondrial. (C) fréquence de ribonucléotide normalisés à 1 000 bases complémentaires pour HincII et KOH traitement bibliothèques sur la lourde (H) ou un brin de lumière (L) de l’ADN mitochondrial. Les chiffres sont adaptées de référence12. Barres d’erreur représentent l’écart-type de la moyenne. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Nom Séquence ARC49 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT ARC76 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNN * N * N ARC77 AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC * A * C ARC78 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC84 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC85 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC86 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC87 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC88 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC89 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC90 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC91 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC93 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC94 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC95 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC96 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC97 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC98 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC99 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC100 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC101 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC102 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC103 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC104 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC105 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC106 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC107 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC140 / 5AmMC6/ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT Tableau 1 : oligonucléotides. Voici les oligonucléotides servant de HydEn-suiv. Caractères gras indique l’indexation. * indique une liaison phosphorothioate. ARC140 contient un groupe amino-5´ au lieu d’un groupe de 5´-OH, en combinaison avec un linker de C6. Cette modification réduit la formation de concatémères ARC140 au cours de la ligature.

Discussion

Nous présentons ici une technique pour carte et quantifier des ribonucléotides ADNg et ADNmt en particulier, par la simple introduction de clivage de l’ADN à des sites spécifiques de séquence du génome comme ajout au protocole HydEn-seq établi simultanément. Cette étude se concentre sur l’ADN mitochondrial humain, initialement la méthode HydEn-seq a été développée chez Saccharomyces cerevisiae, illustrant la traduction de la méthode aux autres organismes12,16.

Pour des résultats fiables obtenus à partir de cette approche, certaines étapes critiques est à noter : (A) étant donné que les adaptateurs de séquençage ligaturer à tous les 5´-extrémités disponibles, il est essentiel de travailler avec ADN hautement intact. ADN devrait être isolé et bibliothèques doivent être faits de préférence immédiatement après l’isolement d’ADN, ou l’ADN peut être conservé à-20 ° C. Il n’est pas recommandé pour stocker l’ADN dans le réfrigérateur pendant une longue période ou de congeler et de décongeler à plusieurs reprises. (B) pour générer des bibliothèques adaptés avec cette méthode, il est crucial d’effectuer le traitement de KOH de l’ADN dans un four d’incubation, plutôt que d’un bloc de chauffage, assurant un chauffage homogène de l’ensemble de l’échantillon et l’hydrolyse quantitative. (C) en outre, il est essentiel de contrôler la qualité des bibliothèques avant la mise en commun et de séquençage. L’ADN doivent être quantifiées et analysées en utilisant un système d’électrophorèse automatisée afin d’assurer une quantité adéquate de bibliothèque ADN, confirmer les tailles appropriées fragment et vérifier les dimères d’amorce.

Pour une analyse des données significatives, il est également important de noter que la valeur informative de cette méthode dépend des contrôles appropriés afin d’évaluer les comtes de fond et les préjugés de séquence ou de la rive. Régulièrement, nous atteignent un rendement de cartographie dans des échantillons de KCl de près de 70 % quand seulement digérer avec l’endonucléase spécifique de séquence (Figure 2 b, panneaux de gauche). En outre, il est important de confirmer que le traitement de l’endonucléase est sans incidence sur l’ensemble détection des ribonucléotides incorporés en comparant HincII traitées et non traitées des échantillons (Figure 3 b). Dans ces expériences, nous avons utilisé HincII d’introduire les réductions spécifiques au site, même si les autres enzymes de restriction haute fidélité pourraient également être utilisés.

Le protocole pourrait être adapté pour étudier d’autres types de lésions de l’ADN qui peuvent être traitées à 5´-phosphate ou 5´-OH se termine. L’exactitude des résultats dépend de la spécificité du traitement et nécessite des contrôles appropriés (par exemple, le type sauvage ou non traitées) pour vérification. En outre, lors de l’adaptation de cette méthode à d’autres applications ou pour une utilisation avec d’autres organismes, on devrait considérer que la méthode dans sa configuration actuelle nécessite environ 1 µg d’ADN qui est traitée dans une bibliothèque. Puisque le nombre d’extrémités repose sur le nombre des ribonucléotides embarqués, qui varie en fonction de l’organisme ou mutant, échantillons, y compris un nombre inférieur de ribonucléotides nécessiterait plus d’entrée d’ADN afin de générer un nombre suffisant des extrémités de la construction de la bibliothèque ultérieures. De même, si les échantillons d’ADN ont un nombre beaucoup plus élevé des ribonucléotides, il faudrait également utilisant moins d’entrée de l’ADN pour obtenir des conditions optimales pour la ligature, synthèse du deuxième brin et amplification par PCR. Il convient de noter que la construction de la bibliothèque comme décrit dans le présent protocole a également produit des données couvrant le génome nucléaire (comme indiqué dans la Figure 2D) et seulement l’analyse des données se concentrait sur l’ADN mitochondrial. Ce qui montre que des génomes plus grands avec des fréquences de ribonucléotide modérément inférieures sont également capturés par cette méthode.

Lors de l’examen de cette méthode, certaines restrictions devraient être prises en compte : bien que cette méthode devrait, en théorie, être applicable à pratiquement n’importe quel organisme, un génome de référence approprié est nécessaire pour l’alignement des lectures. En outre, les résultats obtenus par notre protocole représentent les lectures d’un grand nombre de cellules. Patrons d’incorporation de ribonucléotide spécifique d’un sous-ensemble de cellules ne peuvent être identifiés par cette approche. Si les ribonucléotides sont mappées dans des génomes plus grands avec un très faible nombre de ribonucléotides, il peut être difficile de discriminer des ribonucléotides de pseudos aléatoires et des contrôles appropriés sont donc nécessaires.

La méthode que nous décrivons ici, étend les techniques disponibles en vivo comme HydEn-Seq16, Ribose-Seq17, Pu-Seq18ou emRiboSeq19. Ces approches tirer profit de la sensibilité des ribonucléotides embarqués à alcaline ou traitement de RNase H2, employant respectivement, séquençage de prochaine génération pour identifier des ribonucléotides Génome-large, qui permet leur cartographie et la comparaison des incorporation relative. Par clivage de la séquence d’ADN spécifique, tel que décrit ci-dessus, en plus de l’hydrolyse alcaline à ribonucléotides embarqués, les lectures de ribonucléotides peuvent être normalisées pour ces sites de clivage, ce qui permet non seulement l’identification et la cartographie des ribonucléotides, mais aussi leur quantification pour chaque molécule d’ADN. L’application de notre technique dans le cadre des maladies liées à la réplication de l’ADN, la réparation de l’ADN et TLS pourrait fournir une meilleure compréhension du rôle des ribonucléotides sous-jacents des mécanismes moléculaires et l’intégrité du génome en général.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été financée par le Conseil de recherche suédois (www.vr.se) accorde à l’ARC (2014-6466 et la Fondation suédoise pour la recherche stratégique (www.stratresearch.se) à l’ARC (ICA14-0060). Chalmers University of Technology a contribué financièrement à MKME durant ce travail. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit.

Materials

10x T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer New England Biolabs B0201S
10x T4 RNA Ligase Reaction Buffer New England Biolabs B0216L
1x PBS Medicago 09-9400-100 dissolve 1 tablet in H2O to a final volume of 1 L
2-Propanol Sigma-Aldrich 33539-1L-GL-R
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2940CA
50 mL Centrifuge Tube VWR 525-0610
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP, 10 mM) New England Biolabs P0756S dilute with EB to 2 mM
Agilent DNA 1000 Kit Agilent Technologies 5067-1504
BSA, Molecular Biology Grade (20 mg/mL) New England Biolabs B9000S diltue with nuclease-free H2O to 1 mg/mL
Buffer EB QIAGEN 19086 referred to as EB
CleanPCR paramagnetic beads CleanNA CPCR-0050
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix (10 mM each) New England Biolabs N0447L dilute with EB to 2 mM
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement Gibco 61965026
DynaMag 96 Side Thermo Fisher 12331D
Ethanol 99.5% analytical grade Solveco 1395 dilute with milliQ water to 70%
Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA, 0.5 M) Sigma-Aldrich 03690-100ML
Fetal bovine serum Gibco 10500056
HEPES buffer pH 8.0 (1 M) sterile BC AppliChem A6906,0125
Hexammine cobalt(III) chloride (CoCl3(NH3)6) Sigma-Aldrich H7891-5G dissolve in nuclease-free H2O for 10 M solution, sterile filter. CAUTION: carcinogenic, sensitizing and hazardous to aquatic environment.
HincII New England Biolabs R0103S supplied with NEBuffer 3.1
Hybridiser HB-1D Techne FHB4DD
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) Kapa Biosystems KK2602
Lysis buffer 50 mM EDTA, 20 mM HEPES, NaCl 75 mM, Proteinase K (200 µg/mL), 1% SDS
Micro tube 1.5 mL Sarstedt 72.690.001
Microcentrifuge 5424R Eppendorf 5404000014
Microcentrifuge MiniStar silverline VWR 521-2844
Multiply µStripPro 0.2 mL tube Sarstedt 72.991.992
Nuclease-free water Ambion AM9937
Phenol – chloroform – isoamyl alcohol (25:24:1) Sigma-Aldrich 77617-500ML
Potassium chloride (KCl) VWR 26764.232 dissolve in nuclease-free H2O for 3 M solution, sterile filter
Potassium hydroxide (KOH) VWR 26668.296 dissolve in nuclease-free H2O for 3 M solution, sterile filter
Proteinase K Ambion AM2546
Qubit 3.0 Fluorometer Invitrogen Q33216
Qubit Assay Tubes Invitrogen Q32856
Qubit dsDNA BR Assay Kit Invitrogen Q32850 CAUTION: Contains flammable and toxic components
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q32851 CAUTION: Contains flammable and toxic components
Refrigerated Centrifuge 4K15 Sigma Laboratory Centrifuges No. 10740
SDS Solution, 10% Invitrogen 15553-035
Sodium acetate buffer solution, pH 5.2, 3 M (NaAc) Sigma-Aldrich S7899
Sodium chloride (NaCl) VWR 27810.295 dissolve in nuclease-free H2O for 5 M solution, sterile filter
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
T4 Polynucleotide Kinase (3' phosphatase minus) New England Biolabs M0236L
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) New England Biolabs M0204L supplied with PEG 8000 (50%)
T7 DNA Polymerase (unmodified) New England Biolabs M0274S supplied with 10x T7 DNA Polymerase Reaction Buffer
TE Buffer Invitrogen 12090015
ThermoMixer F2.0 Eppendorf 5387000013
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References

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Kreisel, K., Engqvist, M. K., Clausen, A. R. Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA. J. Vis. Exp. (129), e56551, doi:10.3791/56551 (2017).
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